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腺病毒主要晚期转录单位上URE调控元件结合蛋白的筛选及其初步功能研究

作　者: 段素素
导　师: 刘力；王树蕙
学　校: 中国协和医科大学
专　业: 病原生物学
关键词: 腺病毒结合蛋白医科大学硕士学位论文蛋白质相互作用转录单位文库质粒诱饵基因表达
分类号: R373
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
下　载: 18次
引　用: 1次
阅　读: 论文下载

内容摘要

腺病毒在宿主细胞中的生活周期以病毒DNA复制的起始为界限被分为早期感染阶段和晚期感染阶段。早期基因编码病毒的调控蛋白，晚期基因主要编码结构蛋白，早晚期阶段基因的表达是一个受到各个水平严密调控的过程。腺病毒的主要晚期转录单位(Maior late transcription unit，MLTU)上有5个poly A信号而将其分为L1到L5 5个转录区。腺病毒生活周期中，MLTU上5个转录区的使用存在一个显著的时间变化：早期阶段MLTU转录水平比较低，并且主要只利用了MLTU上L1一个转录区，L1编码和病毒包装有关的非结构蛋白；而在晚期阶段MLTU转录水平升高，并且腺病毒利用了MLTU上所有5个转录区，并且腺病毒大部分晚期蛋白尤其是病毒结构蛋白都从这5个转录区转录表达出。所以，在腺病毒早晚期感染阶段转换的调控中，有一个重要问题就是：腺病毒如何在不同的感染阶段使用MLTU上不同的转录区?即MLTU上不同poly A位点使用转换的机制。研究发现L1 poly A位点上游存在一个上游调控元件(upstream regulatory element，URE)，在早期感染阶段，URE能够使转录出的包含URE的L2、L3转录本在核内不稳定，不能有效进入胞浆成熟mRNA库，从而抑制L2、L3的基因表达，使L1成为早期阶段主导使用的转录本。本实验室利用HeLa细胞核液与URE RNA的紫外交联的实验发现，URE可同至少两个30kd左右的蛋白结合。为进一步研究URE在异源poly A信号上游时抑制基因表达的机制，本课题采用酵母三杂交的方法筛选HeLa cDNA文库，寻找URE结合蛋白，并对候选的RNA结合蛋白后进行功能研究，发现该蛋白参与URE抑制基因表达的机制，为研究腺病毒早晚期转换调控的机制和细胞核内转录后水平的调控提供新的依据。酵母三杂交系统由三部分组成：DNA结合结构域融合蛋白、杂交RNA分子、DNA激活结构域融合蛋白。在利用cDNA文库筛选URE RNA结合蛋白时，URE分子是“诱饵”，融合有DNA激活结构域的cDNA文库质粒是“诱饵”要寻找的“猎物”。我们首先测定了预制HeLa cDNA文库的滴度，克隆扩增了文库的3×10~7个克隆，为文库原始容量的10倍，有效保证扩增后的文库的完整性。然后，通过对URE序列的碱基分析，发现URE上有RNA聚合酶Ⅲ的终止子，所以选择下游的MD功能片段作为三杂交中的“诱饵”序列。我们还使用了RNA structure软件对MD序列的两种“诱饵”RNA分子进行了二级结构的分析。预测的两种“诱饵”RNA分子在最低自由能下的二级结构显示，leader-MD-MS2序列没有稳定的异源序列间的配对，各部分能够保持

全文目录

中文摘要  4-6
英文摘要  6-8
缩略语表  8-9
前言  9-12
技术路线  12-13
实验材料  13-25
实验方法  25-45
实验结果  45-62
讨论  62-72
小结  72-73
综述  73-81
附录  81-88
致谢  88

腺病毒主要晚期转录单位上URE调控元件结合蛋白的筛选及其初步功能研究

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