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汉坦病毒M1基因克隆及其在毕赤酵母系统中的表达

作　者: 李力
导　师: 陈锦英
学　校: 天津医科大学
专　业: 病原生物学
关键词: 汉坦病毒 M1基因 载体 巴氏毕赤酵母 表达
分类号: R373.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
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内容摘要


目的:汉坦病毒(Hantavirus,HV)是肾综合征出血热(Hemorrhagic Fever with Renal Syndrome,HFRS)的病原体,人感染后可导致HFRS和汉坦病毒肺综合征(Hantavirus Pulmonary Syndrome,HPS)两种严重的疾病。HV的包膜糖蛋白(Glycoprotein,GP)可刺激机体产生中和抗体,GP包括G1和G2两种蛋白。本文将HV编码G1的M1基因在巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris,P.pastoris)表达系统中进行了克隆和表达,并对表达产物进行鉴定。 内容和方法:使用Vero-E6细胞系分别增殖HV汉滩型(HTN)Z10株和汉城型(SEO)L99株。待HV增殖到一定程度,即免疫荧光法检测细胞中HV感染量达+++～++++时,提取总RNA,RT-PCR扩增编码G1蛋白的M1基因片段,连接入pMD18-T simple载体,测序验证目的片段。使用限制性内切酶Xba Ⅰ、Kpn Ⅰ对重组质粒进行双酶切以获得目的片段,经纯化后,连接入经同样内切酶双酶切的毕赤酵母分泌表达载体pPICZαA,接头测序验证其读码框架。将重组表达载体经BstX Ⅰ酶切线性化后电转化入处于感受态的P.pastoris,重组菌株经Zeocin筛选,将阳性重组子传代4次以稳定其性状。提取重组菌株染色体DNA,PCR检测目的片段是否整合入P.pastoris染色体。使用甲醇诱导法对重组菌株进行目的蛋白的诱导表达,并应用Westem Blot和Dot Blot对表达产物进行鉴定。 结果:M1基因RT-PCR产物连接入pMD18-T simple载体后,获得重组质粒pMD18T-Z10M1、pMD18T-L99M1。经测序后与GenBank登录的核苷酸序列进行比较,与Z10株RNA序列(AF 276987)相比,目的片段有9个碱基突变:与L99株mRNA序列(AF 288298)相比,目的片段有5个碱基突变。经限制性内切酶KpnⅠ、XbaⅠ对其进行双酶切并定向克隆入经同样内切酶双酶切的质粒载体pPICZαA中,重组质粒分别命名为pPICZαA-Z10M1、pPICZαA-L99M1。

全文目录


一、摘要  6-10
  1 中文摘要  6-8
  2 英文摘要  8-10
二、前言  10-12
三、材料与方法  12-40
  1 实验材料  12-13
    1.1 病毒、细胞、质粒和菌株  12
    1.2 主要试剂  12-13
    1.3 主要仪器  13
  2 实验方法  13-40
    2.1 细胞培养液，维持液和冻存液的配制  13
    2.2 培养基的配制  13-14
    2.3 PCR引物合成  14-15
    2.4 病毒的培养及收获  15-17
    2.5 细胞总RNA(病毒RNA)的提取  17-18
    2.6 RT-PCR扩增M1基因  18-19
    2.7 M1基因克隆到pMD18-T simple载体中  19-24
    2.8 M1基因毕赤酵母分泌表达载体的构建  24-29
    2.9 重组质粒转化毕赤酵母菌  29-34
    2.10 重组菌株目的蛋白的诱导表达(小量培养)  34-35
    2.11 表达产物鉴定  35-40
四、结果  40-70
  1 汉坦病毒培养  40
  2 汉坦病毒Z10株和L99株M1基因RT-PCR扩增结果  40-41
  3 M1基因克隆到pMD18-T simple载体中及鉴定  41-53
    3.1 Z10株M1基因T-A克隆鉴定结果  41
    3.2 L99株M1基因T-A克隆鉴定结果  41-42
    3.3 汉坦病毒M1基因序列分析结果  42-53
  4 汉坦病毒M1基因毕赤酵母分泌表达载体的构建及鉴定  53-57
    4.1 Z10株M1基因定向克隆鉴定结果  53-55
    4.2 L99株M1基因定向克隆鉴定结果  55-57
    4.3 M1基因定向克隆载体序列测定结果  57
  5 重组质粒转化毕赤酵母菌  57-62
    5.1 重组质粒的线性化  57-58
    5.2 重组菌株的鉴定  58-62
  6 表达产物鉴定  62-70
    6.1 表达产物的浓缩  62
    6.1 SDS-PAGE结果  62-66
    6.3 Western Blot鉴定  66-68
    6.4 Dot Blot鉴定  68-70
五、讨论  70-81
  1 HV感染的流行病学  70-72
  2 HV M基因的结构和功能  72-74
  3 毕赤酵母表达系统  74-76
  4 酵母表达载体的构建和毕赤酵母的转化  76-79
  5 目的蛋白的表达和鉴定  79-81
六、结论  81-83
七、致谢  83-84
八、参考文献  84-86

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 医学微生物学（病原细菌学、病原微生物学） > 人体病毒学（致病病毒） > 节肢动物传播的病毒（虫媒病毒）
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