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SARS冠状病毒Mc区的克隆表达及表达蛋白抗原活性研究

作　者: 胡族琼
导　师: 龙北国；赵卫
学　校: 第一军医大学
专　业: 医学微生物学
关键词: SARS冠状病毒 M蛋白Mc区 克隆 表达 抗原活性
分类号: R373
类　型: 硕士论文
年　份: 2005年
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内容摘要


一、研究背景和目的 SARS冠状病毒(SARS-CoV)是一种新现的病原微生物,属于巢状病毒目(Order:Nidovirales)、冠状病毒科(Family:Coronaviridae)、冠状病毒属(Genus:Coronavirus),基因组为单链正RNA。SARS-CoV可引起严重急性呼吸综合征(Severe Acute Respiratory Syndrome, SARS),传染性强,死亡率高。首发病例于2002年11月出现在中国广东,疫情很快波及全球。目前,SARS暂时得到控制,但在SARS防治中许多关键问题尚待解决,如SARS-CoV入侵细胞及致病机制、特异性抗病毒药物、快速诊断试剂和疫苗的研制等。 研究表明,冠状病毒S蛋白(棘突蛋白)和M蛋白(膜蛋白)具有免疫原性,能够诱导中和抗体产生。M蛋白(membrane protein)是最丰富的结构蛋白,它跨膜双分子层3次,短氨基端在膜外,长羧基端在膜内,由121个氨基酸组成,被认为是与核蛋白体作用的区域。 本项研究分析了82株SARS-CoV M基因的变异情况,发现氨基酸变异主要发生在膜外和跨膜区域,膜内区域变异极少。对SARS-CoV M蛋白的B细胞抗原表位进行预测,结果表明M蛋白的B细胞抗原表位85%以上都位于M蛋白膜内区(Mc蛋白)。另有研究者预测,M蛋白所含T细胞激活表位主要集中在第81-220位氨基酸之间,占84.7%,即主要集中在Mc蛋白区域内。所以,就抗原活性而言,Mc蛋白应是M蛋白的代表区段,而且Mc蛋白的疏水性小于M蛋白的疏水性,更易于大量体外表达。因此,本项研究将靶蛋白锁定

全文目录


中文摘要  5-9
英文摘要  9-13
前言  13-18
第一部分 SARS冠状病毒GD322株M基因序列测定及分析  18-32
  1．1 材料  18-19
  1．2 实验方法  19-22
    1．2．1 引物设计与合成  19
    1．2．2 SARS冠状病毒GD322株RNA的提取  19
    1．2．3 目的基因扩增  19-20
    1．2．4 目的基因的纯化回收  20
    1．2．5 目的基因克隆  20-22
    1．2．6 M基因的序列测定及同源性分析  22
    1．2．7 M基因的生物信息学分析  22
  结果  22-28
  讨论  28-31
  小结  31-32
第二部分 SARS-CoV Mc区重组表达质粒的构建及鉴定  32-44
  2．1 材料  32-35
  2．2 实验方法  35-37
    2．2．1 Mc区片段的获取  35
    2．2．2 目的基因克隆  35
    2．2．3 酶切鉴定  35
    2．2．4 PCR鉴定  35
    2．2．5 表达载体的构建  35-36
    2．2．6 重组表达质粒的筛选与鉴定  36
    2．2．7 阳性重组克隆pET32a(+)／Mc的诱导表达及鉴定  36-37
    2．2．8 免疫印迹(Western-Blot)检测表达蛋白  37
  结果  37-42
  讨论  42-43
  小结  43-44
第三部分 SARS冠状病毒Mc蛋白的表达、纯化及复性  44-55
  3．1 材料  44-45
  3．2 实验方法  45-47
    3．2．1 表达产物可溶性的确定  45
    3．2．2 目的基因表达条件的优化  45
    3．2．3 表达产物的纯化  45-46
    3．2．4 纯化蛋白复性  46-47
  结果  47-52
  讨论  52-54
  小结  54-55
第四部分 SARS-CoV Mc蛋白抗原活性的初步研究  55-63
  4．1 材料  55-56
  4．2 实验方法  56-57
    4．2．1 复性蛋白免疫大白兔  56
    4．2．2 Westen-Blot鉴定制备多克隆抗体的特异性  56-57
    4．2．3 间接ELISA检测复性蛋白免疫原性并测定多抗效价  57
    4．2．4 复性蛋白的耐热实验  57
    4．2．5 复性蛋白与人血清反应  57
    4．2．6 复性蛋白与兔抗229E、OC43血清反应  57
  结果  57-60
  讨论  60-62
  小结  62-63
参考文献  63-67
缩略语词汇表  67-69
致谢  69-70
硕士期间发表论文情况  70-71
学位论文原创性声明  71
学位论文版权使用授权书  71

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 医学微生物学（病原细菌学、病原微生物学） > 人体病毒学（致病病毒）
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