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SARS相关冠状病毒PPA-ELISA和nest-PCR检测方法的建立及联合应用

作　者: 王淑敏
导　师: 贺建华；顾万军
学　校: 湖南农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: PPA-ELISA SARS抗体 SARS冠状病毒聚合酶基因巢式PCR
分类号: S854.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2004年
下　载: 37次
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内容摘要

重症急性呼吸综合症(Severe Acute Respiratory Syndrome，SARS)的病原是SARS冠状病毒(SARS.CoV)，为了调查野生动物和家畜家禽体内携带的冠状病毒的情况以及其与SARS.CoV的基因序列同源性，本研究根据SPA能与多种动物血清IgG结合的特性，建立了间接PPA-ELISA检测多种动物血清中SARS病毒相关抗体的方法；根据SARS冠状病毒聚合酶基因序列设计引物，建立套式PCR(nest-PCR)检测方法。对11种动物146个样品进行RT-PCR检测，并用PCR产物测序。与Genbank中的SARS相关冠状病毒的聚合酶基因进行序列比较，构建系统发育树，分析不同宿主来源动物冠状病毒与SARS冠状病毒的同源性。两种检测方法的实验结果表明： SPA与多种哺乳动物血清中的IgG有较好的结合能力，本实验确定了PPA-ELISA的抗原-抗体最佳反应时间，HRP-SPA与抗体反应最佳时间及底物溶液的显色时间，在此基础上，建立了间接PPA-ELISA检测多种动物血清中SARS病毒相关抗体的检测程序。通过对冠状病毒聚合酶基因的扩增和序列分析，结果表明被检测的动物样品中的冠状病毒聚合酶的保守基因序列与SARS冠状病毒聚合酶的同一位置的基因序列同源性为100％～95.8％。通过对同一动物的PPA-ELISA和nest-PCR检测表明，两种检测的约为符合率60％～70％，两种方法的同时使用对动物冠状病毒的检测有着重要的参考价值。

全文目录

前言  8-10
第一部分PPA-ELISA检测动物血清SARS病毒抗体  10-23
  1.材料和方法  10-15
    1.1 材料  10-11
      1.1.1 动物样品的采集的地域与分布：  10
      1.1.2 抗原与标准血清  10
      1.1.3 主要试剂  10-11
      1.1.4 主要设备  11
      1.1.5 主要溶液  11
    1.2 方法  11-15
      1.2.1 SPA与不同种动物血清中IgG结合力特性的研究  11-12
        1.2.1.1 包被  11
        1.2.1.2 洗涤  11-12
        1.2.1.3 封闭  12
        1.2.1.4 洗涤  12
        1.2.1.5 加SPA-HRP  12
        1.2.1.6 显色  12
        1.2.1.7 测定OD值  12
      1.2.2 间接PPA-ELISA方法的建立  12-13
        1.2.2.1 待检血清的最佳稀释度的确定  12
        1.2.2.2 封闭液的选择  12-13
        1.2.2.3 SPA-HRP合适反应时间的确定  13
        1.2.2.4 抗原和抗体结合最佳反应时间的选择  13
      1.2.3 PPA-ELISA检测不同动物血清SARS病毒相关抗体的反应程序  13-14
        1.2.3.1 抗原的包被  13
        1.2.3.2 洗涤  13
        1.2.3.3 封闭  13
        1.2.3.4 洗涤  13
        1.2.3.5 抗原抗体反应  13
        1.2.3.6 加SPA-HRP  13-14
        1.2.3.7 显色  14
        1.2.3.8 测定OD值  14
        1.2.3.9 临界值确定  14
      1.2.4 间接PPA-ELISA方法与冠状病毒(变异株)IgG抗体检测试剂盒(酶联免疫法)比较试验  14-15
  2.结果  15-20
    2.1 各种动物血清中IgG与SPA的结合力的研  15-17
    2.2 PPA-ELISA工作条件的确定  17-18
    2.3 结果判定  18-19
    2.4 间接PPA-ELISA方法与冠状病毒(变异株)IgG抗体检测试剂盒(酶联免疫法)比较结果  19-20
  3.讨论  20-23
第二部分动物冠状病毒聚合酶基因的部分序列分析  23-37
  1.材料与方法  23-27
    1.1 材料  23-24
      1.1.1 样品来源  23
      1.1.2 主要试剂与试剂盒  23
      1.1.3 引物的设计与合成  23-24
      1.1.4 主要仪器设备  24
    1.2 方法  24-27
      1.2.1 总RNA的抽提  24
      1.2.2 反转录合成cDNA第一链  24-25
      1.2.3 巢式PCR  25-27
      1.2.4 1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物  27
      1.2.5 PCR产物的回收  27
      1.2.6 PCR产物测序  27
      1.2.7 PPA-ELISA与RT-PCR检测结果的比较  27
  2.结果  27-36
    2.1 11种动物146份样品冠状病毒聚合酶基因Nest-PCR检测结果  27-34
    2.2 构建系统发育树  34
    2.3 PPA-ELISA与RT-PCR检测比较结果  34-36
  3.讨论  36-37
结论  37-38
参考文献  38-41
致谢  41-42
符号表  42-44
作者简历  44-45
在读期间著作、论文及重要技术报告登记  45

SARS相关冠状病毒PPA-ELISA和nest-PCR检测方法的建立及联合应用

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