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鸡新城疫荧光PCR检测方法的建立及应用

作　者: 李军
导　师: 牛钟相；吴时友；尹燕博
学　校: 山东农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 鸡新城疫病毒实时荧光PCR 质粒克隆定量
分类号: S854.43
类　型: 硕士论文
年　份: 2005年
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内容摘要

鸡新城疫是由鸡新城疫病毒引起的急性、高度接触性、烈性传染病,对养禽业危害极大。NDV传统的确诊方法主要依赖病毒的分离鉴定及血清学检测(主要包括鸡胚中和试验、琼脂扩散试验、酶联免疫吸附试验等方法),这些方法耗时长、灵敏度低且经验依赖性强。PCR是一种快速准确的检测方法,但产物需经琼脂糖凝胶电泳和溴化己锭(EB,致癌物)染色等,易产生污染和假阳性。现代化生产需要建立一种快速、准确、高效的检测方法。实时荧光PCR技术是一种新型的核酸检测技术,在临床诊断中已经用于细菌、病毒及遗传性疾病的检测,具有极大的应用价值。本研究根据荧光PCR检测原理,利用荧光双链引物建立了鸡新城疫病毒毒实时荧光PCR检测方法。本课题分为三个部分进行研究。第一部分鸡新城疫F蛋白基因的克隆根据GenbankNDVF糖蛋白mRNA全序列,设计了一对特异引物(P1∶5’-CTTGAC ACC TCATAC TGT AT—3’.P2∶5’-CCC AAG CCA TAA TAAGGT CTT-3’)。提取NDV种毒RNA进行反转录,以反转录产物作为模板,利用上述一对引物进行PCR,结果只有以NDV种毒反转录产物为模板可以扩增出623bp的特异条带。紫光灯下切割特异性条带并用V—gene试剂盒进行纯化。纯化产物与pMD 18-T Simple Vector连接,连接产物转化感受态细胞JM109,经蓝白斑筛选和PCR鉴定后,进行测序。结果表明该NDV毒株的F蛋白基因序列与Genebank公布的序列有99%的同源性。

全文目录

中英文缩略表  5-7
中文摘要  7-9
英文摘要  9-12
综述部分  12-32
  一、鸡新城疫及检测方法的研究进展  12-21
    1．病原学研究  12-14
    2．流行病学研究  14-15
    3．最近几年我国ND的发生情况  15-16
    4．诊断方法的研究  16-20
    5．分子生物学诊断技术  20-21
  二、NDV的分子生物学研究现况  21-25
    1． NDV的基因组结构  21-22
    2． NDV的结构蛋白和功能  22-25
  三、实时定量PCR研究进展  25-32
    1． TaqMan探针  27
    2． Amplisensor(Biotronics)  27-28
    3． Molecular beacon  28
    4． Lightcycler  28-29
    5．复合探针法(complex probes)  29
    6． Taqman-MB荧光探针定量PCR技术  29
    7．荧光双链引物法  29-30
    8．通用探针法  30-32
研究部分  32-63
  研究一 NDV北京株F蛋白基因的克隆  32-44
    1．材料与方法  32-39
    2．结果与分析  39-40
    3．讨论  40-44
  研究二鸡新城疫荧光双链引物检测方法的建立  44-55
    1．材料与方法  45-47
    2．结果与分析  47-52
    3．讨论  52-55
  研究三鸡新城疫PCR在ND快速检测中的应用研究  55-63
    1．材料与方法  55-59
    2．结果与分析  59-61
    3．讨论  61-63
结论  63-64
参考文献  64-71
致谢  71-72

鸡新城疫荧光PCR检测方法的建立及应用

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