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高羊茅遗传转化体系的建立及鸭茅和高羊茅耐盐植株的离体筛选

作　者: 晁相蓉
导　师: 张举仁
学　校: 山东大学
专　业: 细胞生物学
关键词: 高羊茅芽尖 betA 农杆菌介导的遗传转化鸭茅耐盐性离体筛选
分类号: S543.9
类　型: 硕士论文
年　份: 2005年
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内容摘要

高羊茅是广泛种植的优良草坪草兼牧草,具有耐践踏、耐瘠溥、抗病、抗干旱等优点。鸭茅是耐荫的优质多年生牧草,适合在林下种植,具有产草量高、叶量丰富、适口性好、抗旱、抗倒伏性强等优点。但是由于高羊茅叶片粗糙、生长缓慢、耐盐性差及易受杂草危害等缺点和鸭茅越冬性差、不耐盐碱、采食率低等原因限制了它们的进一步推广。采用常规育种方法对它们进行种质改良不仅周期长、成效低,而且缺乏必要的遗传背景知识。植物细胞工程和基因工程技术的发展为改良高羊茅和鸭茅的耐盐性及其特定品质提供了一条新途径。由于高羊茅和鸭茅离体培养及再生植株的困难以及转化周期长、效率低等原因制约了其生物技术改良研究的进展。本工作以高羊茅三个基因型的无菌黄化种子苗的茎尖为外植体,在加有2,4-D7mg/L和6-BA3mg/L的培养基诱导产生丛生芽。将丛生芽转入附加6-BA4mg/L的培养基继代培养,使丛生芽大量扩增。然后,以丛生芽芽尖为受体,利用根瘤农杆菌（菌株LBA4404,携带mini-Ti质粒pCAMBIA1300-betA-als）介导法进行遗传转化,将betA基因转入高羊茅,并进行了转化条件的优化。最佳转化参数是:切取继代5-7天的高羊茅丛生芽约1mm的芽尖,于OD₆₀₀=0.8-1.2的农杆菌菌液中浸染,负压0.5×10⁵pa处理5分种,不吸去芽尖表面多余菌液,将芽尖转移到继代培养基上在黑暗条件下共培养2天,然后将芽尖转移到添加150mg/L头孢霉素的培养基进行抑菌培养,2周后存活的小芽转移到附加绿黄隆0.6mg/L的培养基上连续筛选3代,每代15天,获得抗性芽。抗性芽频率约为23.7%。抗性芽经增殖后,转移到生根培养基生根,移栽花盆成活率达到95%以上。对转化植株DNA进行PCR和PCR-Southern blotting检测,证实betA基因已转入3个高羊茅品种（千年盛世、盛夏和猎狗V）中。在检测的转化植株中,betA基因阳性率为20.9%,即高羊茅平均转化率为4.95%。部分高羊茅转化芽在继代培养基上扩增后,转入附加1.5%NaCl的培养基上连续培养3代,与对照相比,部分转化芽表现出显著提高的耐盐性。在农杆菌介导的高羊茅遗传转化中,合适的菌液浓度、适宜的负压处理及恰当的共培养时间是影响转化效率的主要因素。乙酰丁香酮（AS）虽能提高转化率但效果不明显。本工作还利用鸭茅和高羊茅无菌种子苗茎尖诱导产生的丛生芽为材料进行耐盐筛选,获得了耐盐性显著提高的鸭茅和高羊茅株系。即在附加1.5%NaCl的培养基上,

全文目录

摘要  6-8
ABSTRACTS  8-10
符号说明  10-12
前言  12-13
第一篇高羊茅遗传转化体系的建立  13-38
  1 高羊茅遗传转化的研究  13-21
    1.1 高羊茅的组织培养及遗传转化的受体系统  13-16
      1.1.1 高羊茅的组织培养  13-15
      1.1.2 高羊茅遗传转化的受体系统  15-16
    1.2 高羊茅遗传转化的方法  16-18
      1.2.1 基因枪轰击法  16
      1.2.2 PEG法  16-17
      1.2.3 农杆菌介导法  17-18
      1.2.4 其它方法  18
    1.3 betA基因的相关研究及应用  18-19
    1.4.als突变基因的功能及应用  19-20
    1.5.本工作的目的和意义  20-21
  2 材料与方法  21-27
    2.1 材料  21-22
      2.1.1 高羊茅品种  21
      2.1.2 农杆菌菌株和质粒  21
      2.1.3 药品、试剂和溶液  21-22
      2.1.4 培养基  22
    2.2 方法  22-27
      2.2.1 高羊茅芽尖转化受体体系的建立  22-23
        2.2.1.1 高羊茅无菌种子苗的获得  22-23
        2.2.1.2 高羊茅丛生芽体系的诱导及继代培养  23
      2.2.2 除草剂筛选浓度的确定  23
      2.2.3 农杆菌培养  23
      2.2.4 高羊茅芽尖的转化与共培养  23-24
      2.2.5 抗性芽的筛选  24
      2.2.6 抗性芽的生根与移栽  24
      2.2.7 CTAB法微量提取高羊茅叶片DNA  24-25
      2.2.8 转化植株的PCR检测  25
      2.2.9 转化植株PCR-Southern blot检测  25-26
      2.2.10 抗性芽的耐盐性鉴定  26-27
  3 结果与分析  27-34
    3.1 高羊茅芽尖转化受体体系的建立  27-29
      3.1.1 无菌种子苗的获得  27
      3.1.2 高羊茅丛生芽体系的诱导和继代培养  27-29
    3.2 除草剂筛选浓度的确定  29
    3.3 转化植株的产生和检测  29-31
      3.3.1 转化植株的产生  29-30
      3.3.2 转化植株的PCR和PCR-Southern blot检测  30-31
    3.4 转化植株的耐盐性鉴定  31
    3.5 高羊茅遗传转化条件的优化  31-34
      3.5.1 菌液浓度对抗性芽频率的影响  31-32
      3.5.2 真空渗透及浸染时间对抗性芽频率的影响  32
      3.5.3 共培养时间对转化率的影响  32-33
      3.5.4 AS对抗性芽频率的影响  33-34
  4 讨论  34-38
    4.1 高羊茅无菌种子苗获得的条件  34
    4.2 农杆菌介导的高羊茅芽尖转化体系的建立  34-37
      4.2.1 高羊茅芽尖转化体系建立的意义  34-36
      4.2.2 提高高羊茅转化率的措施  36-37
    4.3 转betA高羊茅的意义  37-38
第二篇利用离体筛选技术获得鸭茅和高羊茅耐盐植株  38-48
  1 鸭茅组织培养研究进展  38-39
  2 材料与方法  39-41
    2.1 植物材料  39
    2.2 培养基  39
    2.3 方法  39-41
      2.3.1 鸭茅丛生芽体系的建立  39
      2.3.2 高羊茅丛生芽体系的建立(同第一篇)  39
      2.3.3 鸭茅和高羊茅耐盐苗的离体筛选  39-40
      2.3.4 鸭茅和高羊茅耐盐植株的生根与移栽  40-41
  3.结果与分析  41-47
    3.1 鸭茅种子的灭菌及萌发  41
    3.2 丛生芽的诱导与继代培养  41-42
      3.2.1 鸭茅丛生芽的诱导与继代培养  41-42
      3.2.2 高羊茅丛生芽的诱导与继代培养(同第一篇)  42
    3.3 鸭茅和高羊茅的耐盐筛选及耐盐植株的获得  42-45
      3.3.1 鸭茅耐盐筛选  42-44
      3.3.2 高羊茅的耐盐筛选  44-45
    3.4 鸭茅和高羊茅丛生芽的生根与移栽  45-47
      3.4.1 鸭茅丛生芽的生根与移栽  45-46
      3.4.2 高羊茅丛生芽的生根与移栽(同第一篇)  46-47
  4 讨论  47-48
参考文献  48-56
致谢  56-57
攻读学位期间发表的论文论著  57-58
学位论文评阅及答辩情况表  58-59

高羊茅遗传转化体系的建立及鸭茅和高羊茅耐盐植株的离体筛选

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