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鲍鱼17β羟基类固醇脱氢酶12的结构与功能鉴定

作　者: 高云峰
导　师: 蔡中华
学　校: 清华大学
专　业: 海洋生物学
关键词: 17-beta-羟基类固醇脱氢酶内分泌系统类固醇激素雌酮雌二醇
分类号: S917.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 32次
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内容摘要

由于人们对软体类动物内分泌系统欠缺了解,类固醇激素类物质在软体动物体内是否如同它们在高等动物,特别是哺乳类动物一样行使内分泌信号物的功能,一直存在争议。17-beta-羟基类固醇脱氢酶家族在高等动物的内分泌系统中起着关键作用,其主要作用是催化雌酮与雌二醇、雄烯二酮与睾酮之间的相互转化,从而掌握着动物体内无活性和有活性的主要激素的平衡,不同的17-beta-羟基类固醇脱氢酶家族成员主要负责上述两组物质之中某一对的一种单向反应。我们通过构建鲍鱼cDNA文库并进行序列筛选以及提取组织RNA并反转录cDNA后的锚定PCR获得了包括完整开放阅读框在内的核酸序列及相应的多肽序列,经过大量的生物信息学比对,我们发现所获得的序列与其他物种的17-beta-羟基类固醇脱氢酶12相似度最高,通过构建细胞表达载体,转染293-t细胞,并分别使用雌酮和雌二醇为底物检测其底物特异性。通过上述实验,我们发现目标序列可以催化由雌酮向雌二醇的转化。通过定量PCR实验检测目标序列在不同生理阶段的组织分布及表达量变化,我们发现在雌性九孔鲍产卵前,产卵中及产卵后三个生理阶段的肝胰脏和性腺组织中其表达量均呈现先升高,再降低的变化变化趋势,且其在性腺组织的表达量高于其在肝胰脏组织中的表达量。说明在九孔鲍体内存在类似高等动物内分泌系统中的关键酶类17-beta-羟基类固醇脱氢酶家族成员,它参与了九孔鲍体内类固醇类激素物的加工过程。

全文目录

摘要  3-4
Abstract  4-5
常用符号对照表  5-8
第1章前言  8-18
  1.1 软体动物甾醇类激素的合成与代谢  8-11
  1.2 甾醇类性激素在软体动物性别分化、发育、成熟过程中的潜在作用  11-12
  1.3 17β羟基类固醇脱氢酶（17β-HSD）  12-16
    1.3.1 17β-HSD 的基因  13-14
    1.3.2 17β-HSD 的功能  14-16
  1.4 选题的背景及意义  16-18
第2章材料与方法  18-40
  2.1 实验材料与试剂  18-19
    2.1.1 主要试剂及耗材  18-19
    2.1.2 主要仪器  19
  2.2 实验方法  19-40
    2.2.1 文库构建及序列筛选  19-20
    2.2.2 生物信息学的结构分析与功能预测  20
    2.2.3 鲍鱼RNA 的提取  20-21
    2.2.4 cDNA 的合成  21
    2.2.5 鲍鱼176eta-HSD12 基因的克隆  21-24
    2.2.6 制备感受态细胞  24-25
    2.2.7 连接产物的转化及阳性克隆的挑选检测  25
    2.2.8 构建pCDNA3.1(+)-176eta-HSD12 质粒  25-26
    2.2.9 pCDNA3.1(+)质粒回收  26
    2.2.10 酶切  26-27
    2.2.11 pcdna3.1(+)-176eta-HSD12 质粒的提取(质粒大提)  27-29
    2.2.12 293-t 细胞的培养  29-32
    2.2.13 转染  32-33
    2.2.14 底物刺激实验  33-34
    2.2.15 产物浓度的测定  34-37
    2.2.16 17βHSD12 九孔鲍体内表达量变化的检测  37-40
第3章结果  40-55
  3.1 生物信息学分析结果  40-45
    3.1.1 文库cDNA 序列筛选  40-41
    3.1.2 氨基酸序列的结构与功能分析  41-45
  3.2 组织提取目标片段并构建质粒  45-55
    3.2.1 组织提取目标片段  45
    3.2.2 构建转染质粒  45-46
    3.2.3 底物刺激实验结果与讨论  46-53
    3.2.4 17βHSD12 在雌性九孔鲍体内不同生理阶段的组织分布  53-55
第4章结论与讨论  55-57
  4.1 结论  55
  4.2 讨论  55-57
参考文献  57-60
致谢  60-61
个人简历  61

鲍鱼17β羟基类固醇脱氢酶12的结构与功能鉴定

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