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玉米温敏型核雄性不育基因的差异表达

作　者: 刘艳鸣
导　师: 张银东
学　校: 华南热带农业大学
专　业: 作物遗传育种
关键词: 琼42Qms 琼42 温敏型核雄性不育抑制扣除杂交差异片段
分类号: S513
类　型: 硕士论文
年　份: 2002年
下　载: 92次
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内容摘要

玉米是我国三大粮食作物之一，由于我国玉米种植面积不可能进一步扩大，玉米增产只能靠单产产量的增加。就研究现状而言，利用雄性不育系生产杂交种是进一步提高单产的主要途径。由于目前对玉米雄性不育的遗传机理缺乏足够的了解，使得对玉米雄性不育系的利用往往会碰到一些致命性问题。本研究旨在分离与核雄性不育相关的差异cDNA片段，为克隆全长基因、分析其功能及遗传机理奠定基础。本研究首先对琼42Qms和琼42各分化时期的雄穗进行跟踪解剖、显微观察，并观察相应植株的叶片数，最后确定当可见叶为11-13片叶，展开叶为7.5-8.8片时琼42Qms和琼42的雄穗处于小花分化期，取材即依据以上数据进行。提取琼42Qms和琼42小花分化期雄穗的总RNA，纯化得mRNA，以琼42Qms的mRNA作检测样本(Tester)、琼42的mRNA作参照样本(Driver)进行抑制扣除杂交，其产物进行克隆得差减文库。从文库中挑取22个白色菌落，提质粒、酶切鉴定，其中有20个菌落中有插入片段，为阳性菌落。从20个阳性菌落中取10个提质粒、酶切，用低熔点琼脂糖凝胶回收酶切片段，DIG标记，作探针；与琼42Qms和琼42的小花分化期雄穗总RNA进行杂交，获得—个仅在琼42Qms中特异表达的差异cDNA片段。以该片段作探针与琼42Qms小花分化期、抽穗成熟期的叶片和雄穗的总RNA进行杂交，结果表明，该片段只在小花分化期的雄穗中表达，说明该片段可能与育性有关。对该片段进行测序，所得序列在Genebank库中进行同源性检索，得知该序列在Genebank库中无同源序列，用PC-gene软件分析得知该片段包含一个基因的部分阅读框架，是个新基因片段。

全文目录

中文摘要  6-7
1 前言  7-26
  1．1 玉米雄性不育在育种中的应用及前景  8-13
    1．1．1 细胞质雄性不育  8-11
    1．1．2 核雄性不育  11-13
  1．2 玉米雄穗的分化过程  13-15
  1．3 差异表达基因（片段）的分离  15-24
    1．3．1 示差筛选和扣除杂交  15-16
    1．3．2 mRNA差异显示技术  16-17
    1．3．3 RNA指纹技术  17
    1．3．4 代表性差示分析  17-18
    1．3．5 基因表达序列分析  18-19
    1．3．6 抑制扣除技术  19-23
      1．3．6．1 SSH技术的基本原理  19
      1．3．6．2 SSH技术的主要过程  19-21
      1．3．6．3 SSH技术的优缺点评析  21-22
      1．3．6．4 SSH技术的最新研究进展  22-23
    1．3．7 交互扣除RNA差别显示技术  23-24
  1．4 本研究的目的、意义及研究技术路线  24-26
    1．4．1 本研究的目的、意义  24-25
    1．4．2 研究技术路线  25-26
2 材料与方法  26-43
  2．1 材料  26-27
    2．1．1 试验材料  26-27
    2．1．2 菌种  27
    2．1．3 试剂  27
  2．2 方法  27-42
    2．2．1 玉米雄穗分化过程中各时期形态的显微观察  27
    2．2．2 近等位基因系琼42Qms和琼42小花分化期雄穗总RNA提取及mRNA纯化  27-30
      2．2．2．1 小花分化期雄穗总RNA提取  27-28
      2．2．2．2 mRNA的纯化  28-30
    2．2．3 近等位基因系42Qms和琼42差异表达分析  30-39
      2．2．3．1 cDNA第一链合成  30
      2．2．3．2 cDNA第二链合成  30-31
      2．2．3．3 RsaⅠ酶切  31-32
      2．2．3．4 连接接头  32-33
      2．2．3．5 第一次杂交  33
      2．2．3．6 第二次杂交  33-34
      2．2．3．7 PCR扩增  34-36
      2．2．3．8 PCR扩增产物的克隆及重组子的筛选  36-39
        2．2．3．8．1 连接  36
        2．2．3．8．2 宿主菌E．coli DH5α感受态细胞的制备  36-37
        2．2．3．8．3 连接产物转化宿主菌E．coli DH5α感受态细胞  37
        2．2．3．8．4 质粒的微量提取  37-38
        2．2．3．8．5 重组子的酶切鉴定  38-39
    2．2．4 Northen杂交分析  39-42
      2．2．4．1 琼42和琼42Qms小花分化期、抽穗成熟期的叶片、雄穗总RNA的提取  39
      2．2．4．2 DNA探针的制备  39-40
        2．2．4．2．1 利用低熔点琼脂糖凝胶回收目的片段  39
        2．2．4．2．2 DIG树己DNA  39-40
      2．2．4．3 RNA的印迹转移  40-41
        2．2．4．3．1 RNA甲醛电泳的准备  40
        2．2．4．3．2 RNA电泳  40
        2．2．4．3．3 凝胶印迹转移  40-41
      2．2．4．4 预杂交和杂交  41
      2．2．4．5 杂交后洗膜  41-42
      2．2．4．6 免疫检测  42
  2．3 测序  42-43
3 结果与分析  43-48
  3．1 玉米雄穗各分化时期形态的观察  43
  3．2 小花分化期雄穗总RNA的提取  43-44
  3．3 mRNA的纯化  44
  3．4 近等位基因系琼42和琼42Qms的差异表达分析  44-45
  3．5 PCR扩增产物的克隆及重组子筛选  45-46
  3．6 Northern杂交分析  46-47
  3．7 序列分析  47-48
4 讨论  48-51
  4．1 玉米雄穗各分化时期的显微观察  48-49
  4．2 琼42和琼42Qms小花分化期雄穗总RNA的提取  49-50
  4．3 PCR产物的克隆  50
  4．4 近等位基因系琼42和琼42Qms差异表达分析  50
  4．5 差异片段的序列测定及分析  50-51
5 结论  51-52
6 参考文献  52-61
7 英文摘要  61-63
8 附图  63-66
9 致谢  66

玉米温敏型核雄性不育基因的差异表达

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