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铝胁迫下杉木不同无性系银染mRNA差异显示分析

作　者: 庞丽
导　师: 林思祖
学　校: 福建农林大学
专　业: 林木遗传育种
关键词: 杉木铝毒害无性系生根率 mRNA DDRT-PCR 差异片段
分类号: S791.270.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
下　载: 135次
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内容摘要

铝是地壳中含量最丰富的金属元素,通常以难溶性硅酸盐或氧化铝的形式存在,对植物没有毒害,但在酸性条件下（pH＜5）,可溶性的铝(主要是Al³⁺)对大多数植物都会产生毒害。近年来由大气污染引起的酸沉降、农业生产中大量施用生理酸性的化学肥料和根系吸收阴阳离子不平衡等加剧了土壤的酸化,使酸性土壤面积和酸性程度进一步提高。据统计全世界有39.5亿hm²酸性土壤,其中可耕土壤面积为1.79亿hm²,主要分布在热带、亚热带及温带地区,尤其是发展中国家。我国酸性土壤的分布遍及15个省区,总面积为2030万hm²,约占全国土地总面积的21%。我国南方特有的富铝化酸性土壤,为南方森林铝毒害创造了先天的条件。杉木（Cunninghamia lanceolata）是我国南方特有的速生丰产树种,是重要的用材树种,绝大多数是人工纯林。长期以来的林业生产实践表明,杉木连栽的生长量随着连栽代数的增加而普遍下降,其中杉木铝毒害被认为是杉木连栽地力衰退的重要原因之一。本试验以杉木组培苗为实验材料,运用正交实验设计,分析了基本培养基、IBA和NAA不同浓度及配比,以及活性碳的添加等不同的处理对无性系FS01和FS05生根的影响,筛选到了较好的杉木组培苗生根培养基。在组织培养条件下,利用沙培尽可能排除外界干扰因子的影响,对杉木不同无性系生根组培苗进行铝胁迫。通过对铝胁迫下各无性系组培苗的表型症状的观察和统计分析,初步筛选耐铝型和铝敏感型无性系。采用改进并优化了的mRNA差异显示（DDRT-PCR）体系和银染法,研究杉木耐铝型无性系FS10,中间型无性系FS02和铝敏感型无性系FS01在铝胁迫下基因表达的差异,并对差异片段进行克隆和测序,为揭示杉木耐铝胁迫的基因表达模式,运用基因工程调控杉木的耐铝毒害能力及培育耐铝毒害的优良杉木无性系奠定理论基础。研究结果表明:1.在处理1/4MS+IBA0.14mg/L+NAA0.075mg/L几中,杉木组培苗生根效果较好。MS基本培养基对杉木无性系FS01和FS05生根率的影响达极显著水平,IBA对FS01生根率影响显著,NAA对FS05生根率影响显著。同时发现加活性碳的处理,生根率、生根数（条/根）以及根长明显低于不加活性碳的。2.以顶芽褐化腐烂程度,茎和叶的褐化斑点数目和叶的黄化程度等为指标,通过对铝胁迫下杉木无性系FS01、FS02、FS03、FS04、FS05、FS10、FS16、FS18、FS19和FS23组培苗表型症状的初步筛选,获得了耐铝型无性系FS10,中间型无性系FS02和铝敏感型无性系FS01。3.运用正交实验设计,对影响PCR结果的主要因素进行了筛选。聚丙烯酰胺凝胶电泳显示,MgCl₂为2.0ul,dNTP上样量为0.33ul,退火温度设置为38℃的PCR体系,扩增效果较好。4.对6条5’端随机引物2条为一组随机组合后,与3’端3条锚定引物配对,获得45个引物组合。聚丙烯酰胺凝胶电泳显示,其中8对有效引物对扩增效果较好。5.本试验采用水煮法和醋酸钠纯化法相结合的方法进行差异条带的回收,回收产物琼脂糖凝胶电泳条带单一,没有脱尾且较清晰,回收效果较好。6.利用筛选到的有效引物对进行PCR扩增,扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染显色,共获得25条差异片段。从差异片段的分布来看,36%为抑制表达的基因片段,64%为诱导表达的基因片段,以诱导表达的差异片段居多。7.通过同源性比对发现,获得的差异条带中,2条差异片段AB1（313bp）和AB2（329bp）与部分已知基因序列同源性较高。AB1与白杨耐旱相关基因同源性达73.0%,AB2与小麦属与硝酸盐通道相关的基因同源性达59.7%。

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摘要  8-10
Abstract  10-13
第一章前言  13-30
  1 铝毒害作用机制和植物耐铝毒害的研究进展  13-22
    1.1 土壤中铝的存在形态  13-14
    1.2 铝对植物产生毒害的机制  14-17
      1.2.1 铝对根和叶的毒害作用  14-15
      1.2.2 Al~(3+)与Ca~(2+)的相互作用  15-16
      1.2.3 Al~(3+)与细胞骨架的作用  16
      1.2.4 Al~(3+)与功能蛋白的作用  16-17
    1.3 植物耐铝的研究进展  17-22
      1.3.1 植物耐铝的生理生化机制  17-20
      1.3.2 植物抗铝的分子生物学机理  20-22
  2 mRNA差异显示PCR技术的研究进展  22-27
    2.1 DDRT—PCR操作的基本原理  23-24
    2.2 mRNA差异显示PCR技术的优缺点  24-25
    2.3 mRNA差异显示PCR技术的改进  25-26
    2.4 mRNA差异显示PCR在植物抗性研究中的应用  26-27
  3 本实验的研究目的、意义及主要研究内容  27-30
第二章杉木优良无性系组培苗诱导根的研究  30-35
  1 材料与方法  30-31
    1.1 材料来源  30
    1.2 试验方法  30
    1.3 数据处理  30-31
  2 结果与分析  31-33
    2.1 不同处理对杉木生根率的影响  31
    2.2 不同处理对杉木生根数的影响  31-32
    2.3 不同处理对杉木根长的影响  32
    2.4 不同因素及水平对杉木组培苗生根率的显著影响  32-33
    2.5 活性碳对杉木诱导生根的影响  33
  3 小结  33-35
第三章铝胁迫下杉木不同无性系银染mRNA差异显示分析  35-56
  1 材料与方法  35-42
    1.1 试验材料  35
    1.2 试验方法  35-42
      1.2.1 Al胁迫溶液的配制  35
      1.2.2 培养方法  35-36
      1.2.3 材料处理  36
      1.2.4 总RNA的提取,纯化及检测  36-37
      1.2.5 总RNA RT-PCR法  37-39
      1.2.6 聚丙烯酰胺凝胶电泳  39
      1.2.7 银染显色  39
      1.2.8 差异片段的回收及二次PCR扩增  39-40
      1.2.9 差异片段的克隆  40-42
      1.2.10 差异片段的序列测定  42
      1.2.11 序列的比对分析  42
  2 结果与分析  42-53
    2.1 各无性系耐铝性的筛选  42
    2.2 总RNA纯度和完整性的检测  42-43
    2.3 PCR体系的优化和引物的筛选  43-48
    2.4 铝胁迫下杉木不同无性系基因表达差异分析  48-50
    2.5 差异条带的回收与二次扩增  50-51
    2.6 差异片段的克隆  51-52
    2.7 阳性重组克隆的序列分析  52-53
  3 小结  53-56
    3.1 杉木耐铝型和铝敏感型无性系的筛选  53
    3.2 对差异条带回收的优化  53-54
    3.3 铝胁迫下杉木不同无性系基因的差异表达  54-56
第四章结论  56-58
  1 杉木不同无性系组培苗根的诱导  56
  2 杉木耐铝型和铝敏感型无性系的筛选  56
  3 铝胁迫下杉木不同无性系基因的差异表达  56-57
  4 前景与展望  57-58
参考文献  58-65
附录一无性系FS01,FS02和FS10铝胁迫照  65-67
附录二试验所用部分试剂配方  67-68
附录三攻读硕士学位期间发表的学术论文及参加的科研项目  68-69
致谢  69

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