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显性雄性核不育亚麻雄性不育相关基因的研究

作　者: 斯钦巴特尔
导　师: 哈斯阿古拉；张辉
学　校: 内蒙古大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 亚麻雄性核不育 MS2-F 功能验证差异片段表达分析
分类号: S563.2
类　型: 博士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

亚麻(Linium usitatissimum L.)是我国北方地区重要的油料作物和纤维作物或油纤兼用作物。亚麻籽和亚麻籽油具有保健和药用功效。亚油酸具有降低血液中的胆固醇的作用,而α-亚麻酸是生成二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid,EPA)和二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid,DHA)的前提物质,EPA和DHA的适当的混合物具有降低血脂和减少血栓形成的作用。亚麻木酚素具有调节人体激素平衡、抑制癌症等功效。近年来,亚麻的保健、医药功能不断得到开发,对优质品种的需求不断提高。但由于亚麻是自花授粉作物,其遗传变异的扩大和杂种优势的利用却受到限制。因此,亚麻花药、花粉发育过程中有关基因及其启动子的研究对获得基因工程亚麻雄性不育系及亚麻杂种优势的利用具有重要的意义。本文采用同源序列克隆法,从亚麻花蕾中克隆出与拟南芥雄性不育基因-MS2同源的亚麻MS2-F基因并对其进行了序列和表达分析以及蛋白质结构和功能预测。构建MS2-F基因RNAi表达载体,通过农杆菌介导法进行亚麻的遗传转化。同时,开展了显性雄性核不育亚麻可育、不育花蕾mRNA差异表达以及差异表达基因片段序列分析和功能预测等研究,为揭示显性雄性核不育亚麻不育分子机理提供了有价值的线索。研究结果如下:(1)根据拟南芥等其他植物中雄性不育相关基因氨基酸序列的保守性,应用同源序列克隆法,首先在亚麻花蕾中扩增出258bp的一段序列,然后以该序列为基础,通过RACE技术扩增了基因的5′、3′端序列,其大小分别为975bp和869bp。拼接后获得了1911bp的cDNA序列。(2)根据该cDNA序列,设计基因特异引物,扩增基因的全长cDNA和gDNA。测序结果表明,cDNA为1709bp,gDNA为2696bp,序列分析结果显示,该基因含有8个内含子和9个外显。(3)该cDNA中包含一个1608 bp的ORF,编码535个氨基酸,5′非编码区70bp,3′非编码区31bp。推导的蛋白质序列中包含两个雄性不育保守区:NAD结合区域和雄性不育C-末端区域。该基因与油菜、拟南芥雄性不育基因的一致性分别为59.65%和59.16%,为花蕾特异表达基因,推测在亚麻花粉发育过程中与脂酰辅酶A还原酶有相似功能。因此,成功获得了亚麻雄性不育相关基因,将其命名为MS2-F。其cDNA序列及其对应的gDNA序列的基因库登录号分别为EU363493和EU365361。(4)构建了两个MS2-F基因的RNA干扰载体,一个含有该基因非雄性不育保守区序列;另一个含该基因雄性不育保守区序列。并利用农杆菌介导法,将构建的MS2-F基因的RNA干扰载体导入亚麻中,获得了卡那霉素抗性再生苗,现在正在进行生根诱导培养,有望获得抑制MS2-F表达的转基因亚麻植株,为研究MS2-F基因的功能奠定基础。(5)在显性雄性核不育亚麻不育花蕾和可育花蕾mRNA差异显示研究中,共获得有或无差异片段42条。其中29条为不育差异片段,其余的13条为可育差异片段。对这42条差异片段进行反向Northern杂交验证,最终获得了5条不育花蕾阳性片段:G—E07—100、G—E07—330、G—E07—830、G—S273—500、A-S267—300;2条可育花蕾阳性片段G—S274—250、G—S274—450。(6)这些阳性片段经克隆、测序和BLAST序列分析,结果显示:G-E07-100与植物GTP结合蛋白高度同源,在细胞信号转导过程中有调节作用;G-E07-330与已公布的亚麻花蕾的一段cDNA有较高的同源性;G-E07-830与β—木糖苷酶同源性很高,它可能影响了亚麻花药、花粉中碳水化合物的代谢;G-S273-500与NAD+ADP核糖转移酶有很高的同源性;A-S267-300与分泌蛋白高度同源,推测它可能参与了核不育亚麻信号传导途径、形态发生、细胞凋亡等过程,最终影响了雄性不育的发生;G-S274-250和G-S274-450与已知植物的核苷酸碱基序列和氨基酸序列同源性很低,推测它们可能是与育性有关的新基因。(7)将G-E07-100、G-E07-330和G+E07+830阳性差异片选定为3个候选基因,并经过Northern杂交表达分析,进一步证明,这3个基因在不育花蕾中特异表达。

全文目录

摘要  4-7
ABSTRACT  7-14
符号说明  14-16
引言  16-18
一文献综述  18-43
  1.1 植物雄性不育概况  18-23
    1.1.1 植物雄性不育的来源  18-20
      1.1.1.1 天然不育源  18-19
      1.1.1.2 杂交后代中分离  19
      1.1.1.3 人工诱变  19-20
      1.1.1.4 基因工程  20
    1.1.2 植物雄性不育类型  20-23
      1.1.2.1 细胞质雄性不育  20-21
      1.1.2.2 细胞核雄性不育  21-22
      1.1.2.3 核质互作雄性不育  22-23
  1.2 植物花粉的发育过程  23-26
    1.2.1 植物花粉的发育过程  23-24
    1.2.2 花药绒毡层与花粉发育  24-26
  1.3 植物雄性不育突变体研究  26-30
    1.3.1 雄性不育突变的主要时期  26
    1.3.2 影响雄性器官的突变体  26-27
    1.3.3 影响花粉发育的突变  27-28
      1.3.3.1 减数分裂之前和减数分裂时期突变体  27-28
      1.3.3.2 减数分裂后的突变  28
    1.3.4 花粉释放突变体  28-29
    1.3.5 花粉功能突变体  29
    1.3.6 影响雄性育性的配子体突变体  29-30
  1.4 植物花粉发育相关基因的研究进展  30-34
    1.4.1 与花粉发育起始相关的基因  30-31
    1.4.2 与减数分裂相关的基因  31-32
      1.4.2.1 减数分裂前期I相关的基因  31
      1.4.2.2 减数分裂同源重组相关的基因  31-32
      1.4.2.3 减数分裂后期I相关的基因  32
    1.4.3 胞质分裂相关的基因  32-33
    1.4.4 四分体中表达的基因  33
    1.4.5 绒毡层中表达的基因  33-34
    1.4.6 与花粉有丝分裂I相关的基因  34
    1.4.7 生殖细胞有丝分裂相关基因  34
  1.5 亚麻雄性不育研究进展  34-35
    1.5.1 亚麻概述  34-35
    1.5.2 亚麻雄性不育的研究进展  35
  1.6 mRNA差异显示技术  35-39
    1.6.1 mRNA差异显示的优点  36
    1.6.2 mRNA差异显示技术在实际应用中存在的问题  36-37
    1.6.3 mRNA差异显示技术的改进  37-38
    1.6.4 mRNA差异显示技术在植物雄性不育研究中的应用  38-39
  1.7 RNA干涉技术  39-43
    1.7.1 RNA干涉现象的发现  39
    1.7.2 RNAi作用机制  39-40
    1.7.3 RNAi的特征  40-41
    1.7.4 RNAi的应用  41-43
      1.7.4.1 在植物改良中的应用  41-42
      1.7.4.2 细胞信号传导途径的研究  42
      1.7.4.3 基因治疗  42-43
二亚麻雄性不育相关基因MS2-F的克隆和表达分析  43-62
  2.1 材料与方法  44-52
    2.1.1 植物材料及主要试剂  44
    2.1.2 简并引物的设计  44-45
    2.1.3 亚麻基因组DNA和亚麻花蕾总RNA的提取  45-46
    2.1.4 基因保守序列的获得及测序  46-48
      2.1.4.1 RT-PCR  46-47
      2.1.4.2 RT-PCR产物的克隆及测序  47-48
    2.1.5 基因cDNA 3'、5'末端的克隆  48-49
      2.1.5.1 基因cDNA 3'末端的克隆  48
      2.1.5.2 基因cDNA 5'末端的克隆  48-49
      2.1.5.3 利用基因特异引物扩增基因cDNA和gDNA  49
    2.1.6 基因序列分析  49-50
    2.1.7 基因的Northern杂交表达分析  50-52
      2.1.7.1 RNA甲醛变性凝胶电泳及转膜  50-51
      2.1.7.2 探针制备及标记  51
      2.1.7.3 杂交和免疫检测  51-52
  2.2 结果与分析  52-60
    2.2.1 基因保守序列片段的获得  52-53
    2.2.2 基因全长序列的获得  53-54
    2.2.3 基因序列分析  54-59
    2.2.4 亚麻MS2-F基因在不同组织中的表达分析  59-60
  2.3 讨论  60-62
三 MS2-F基因的RNAi表达载体构建及遗传转化  62-75
  3.1 材料与方法  63-69
    3.1.1 植物材料与主要试剂  63-64
    3.1.2 RNAi载体构建策略图  64-65
    3.1.3 亚麻花蕾总RNA的提取和反转录  65
    3.1.4 172片段的克隆及测序  65
    3.1.5 172片段的反向片段和正向片段的制备  65-66
    3.1.6 基因片段172“hpRNA”表达盒的组建  66
    3.1.7 基因片段172“hpRNA”表达盒的酶切鉴定  66-67
    3.1.8 RNAi表达载体构建及鉴定  67
    3.1.9 944片段的RNAi表达载体构建及鉴定  67-68
    3.1.10 冻融法转化农杆菌 LBA4404  68
    3.1.11 农杆菌中质粒的鉴定  68
    3.1.12 亚麻遗传转化  68-69
  3.2 结果与分析  69-74
    3.2.1 MS2-F基因正向片段和反向片段的获得  69-70
    3.2.2 RNAi表达载体的酶切鉴定  70
    3.2.3 农杆菌中质粒的鉴定  70-71
    3.2.4 亚麻遗传转化结果  71-74
  3.3 讨论  74-75
四显性核不育亚麻可育、不育花蕾mRNA差异表达研究  75-98
  4.1 材料及方法  76-81
    4.1.1 植物材料及主要试剂  76-77
    4.1.2 花蕾总RNA的提取  77
    4.1.3 反转录及PCR  77-78
    4.1.4 PCR产物的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染  78-79
      4.1.4.1 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳  78
      4.1.4.2 银染  78-79
    4.1.5 差异片段的回收及二次扩增  79
      4.1.5.1 差异片段的回收  79
      4.1.5.2 差异片段的二次PCR扩增  79
    4.1.6 反向Northern杂交验证  79-80
      4.1.6.1 探针的制备及标记  79-80
      4.1.6.2 点膜  80
      4.1.6.3 杂交及免疫检测  80
    4.1.7 阳性 cDNA差异片段的克隆及序列分析  80
      4.1.7.1 阳性 cDNA差异片段的克隆  80
      4.1.7.2 序列分析  80
    4.1.8 差异片段的Northern表达分析  80-81
  4.2 结果与分析  81-94
    4.2.1 总RNA质量的检测结果  81-83
    4.2.3 差异片段回收后的二次PCR扩增  83
    4.2.4 反向Northern杂交验证  83-84
    4.2.5 阳性差异片段的克隆与检测  84-85
    4.2.6 阳性差异片段的测序结果  85-87
    4.2.7 序列同源性分析  87-93
      4.2.7.1 差异片段G-E07-100的分析结果  87-88
      4.2.7.2 差异片段G-E07-330的分析结果  88-89
      4.2.7.3 差异片段G-E07-830的分析结果  89-91
      4.2.7.4 差异片段G-S273-500的分析结果  91-92
      4.2.7.5 差异片段A-S267-300的分析结果  92
      4.2.7.6 差异片段G-S274-250和G-S274-450的分析结果  92-93
    4.2.8 差异片段的Northern表达分析  93-94
  4.3 讨论  94-98
    4.3.1 花蕾总RNA质量检测  94
    4.3.2 mRNA显示技术缺点及其克服  94-95
    4.3.3 差异片段序列分析讨论  95-96
    4.3.4 绒毡层与雄性不育  96-98
结论  98-100
参考文献  100-116
致谢  116-117
博士期间发表的论文  117

显性雄性核不育亚麻雄性不育相关基因的研究

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