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产ESH酶的红球菌M1的分离鉴定、系统发育、产酶条件、细胞固定及其发酵放大研究

作　者: 潘克侠
导　师: 闵航
学　校: 浙江大学
专　业: 微生物学
关键词: 红球菌 顺式环氧琥珀酸水解酶 序列发育分析 发酵 L(+)酒石酸 细胞固定化
分类号: TQ925
类　型: 硕士论文
年　份: 2004年
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内容摘要


本研究从土壤中筛选到一株产顺式环氧琥珀酸水解酶(ESH)的菌株，经生理生化试验、Biolog碳源利用试验和16S rDNA序列分析系统发育研究，该菌株应为赤红球菌(Rhodococcus ruber)M1。摇瓶试验确定了最佳碳源、氮源、顺式环氧琥珀酸二钠添加时间和添加量。正交试验优化的最佳培养基和培养时间为：葡萄糖1.2％，硫酸铵0.6％，酵母膏0.5％；顺式环氧琥珀酸二钠投加时间为30h，投加量为3.58％；菌体培养时间70h。摇瓶试验单位湿细胞内ESH酶活达750U／g。目前该菌株已经应用于固定化细胞连续生产L(+)酒石酸。本文首次报道红球菌应用于该领域。 通过对菌株M1的80L、800L、5000L逐步工业放大，找到了其在不同发酵罐中发酵规律。菌株M1在80L发酵罐中发酵时，发酵时间53h左右，酶活在300U／g左右，发酵液终pH值为8.5左右。菌株M1在800L发酵时，发酵时间在40h左右，最高酶活在540U／g左右。发酵液终pH值为7.3左右。菌株M1在5000L发酵罐中发酵时，发酵时间在63h左右，菌体最高酶活在550U／g左右，发酵液pH值在7.5左右。 本研究重点考察了在逐步放大过程中补加诱导剂的变化对菌体发酵过程中菌体浓度、发酵液pH值以及不同时间菌体产酶的影响。菌株M1在不同的发酵罐中随着发酵环境的变化，菌体的生长以及产酶的规律差别较大。通过提高培养基的磷酸盐含量、二次补加高pH值的诱导剂以及补加部分有机氮，有效的解决了5000L发酵时菌株在发酵中期发酵液pH值不能回升和产酶较低的问题。分析认为，可能随着环境的改变，菌株产酶需要较高的磷源以及有机氮源才能有效的产酶。 本研究采用κ-卡拉胶-魔芋多糖-羧甲基纤维素钠复合体系进行产ESH酶的红球菌的细胞固定化研究，并采用戊二醛-KCl混合溶液处理固定化细胞。正交试验表明，复合体系最佳组合为卡拉胶0.12％，魔芋多糖0.2％，羧甲基纤维素钠0.3％；处理液成分以及最佳处理时间为，戊二醛0.5％，KCl 1.0％，处理时间为1h。扫描电镜图片显示，综合处理没有对细胞形态产生明显影响，胶体的网络结构呈特殊的网络互穿穴状结构，有利于菌体的包埋。试验表明固定后细胞酶活没有损失，连续30d固定化细胞活性没有明显变化。菌株M1的菌体经固定化放大处理后，立即上柱反应32d内反应液酶活基本稳定。

全文目录


中文摘要  9-10
第一章 文献综述  10-23
  1 酒石酸研究进展  10-16
    1.1 酒石酸的结构和理化特性  10
    1.2 酒石酸的用途  10-12
      1.2.1 酒石酸在食品中的应用  10-11
      1.2.2 在环境修复中的应用  11
      1.2.3 酒石酸在工业中的应用  11-12
      1.2.4 在医学中的应用  12
    1.3 d-酒石酸生产工艺路线  12-15
      1.3.1 生物发酵法  12-13
      1.3.2 半生物合成法  13
      1.3.3 以酒石为原料制备d-酒石酸  13-14
      1.3.4 以顺式环氧琥珀酸二钠为原料制备L-酒石酸-酶法生产L-酒石酸  14
      1.3.5 酶法生产L-酒石酸的原理  14
      1.3.6 DL-酒石酸化学合成生产工艺路线  14-15
    1.4 酒石酸发酵研究的最新进展  15-16
  2 细胞固定化研究进展  16-23
    2.1 固定化细胞技术  16-18
      2.1.1 固定化细胞的依据  16
      2.1.2 固定化细胞的优缺点  16
      2.1.3 固定化细胞的制备方式  16-18
      2.1.4 固定化细胞载体的特性  18
      2.1.5 目前主要采用的载体  18
    2.2 卡拉胶的性质  18-19
    2.3 卡拉胶在固定化细胞中应用实例  19-21
    2.4 细胞固定化方法生产L(+)酒石酸研究进展  21-23
第二章 产ESH酶的红球菌M1的分离、鉴定  23-29
  2.1 材料和方法  23-25
    2.1.1 菌株  23
    2.1.2 培养基和培养条件  23
    2.1.3 试剂  23-24
    2.1.4 菌株M1的分类鉴定  24
      2.1.4.1 形态学特征  24
      2.1.4.2 分离菌株的BIOLOG-GP鉴定  24
    2.1.5 分离菌株G+Cmol％含量的测定  24
    2.1.6 分离菌株16S rDNA PCR扩增和序列测定  24
    2.1.7 系统发育树构建  24
    2.1.8 顺式环氧琥珀酸水解酶活性和酒石酸含量测定的测定  24-25
  2.2 结果和分析  25-28
    2.2.1 分离菌株的形态  25
    2.2.2 M1菌株的BIOLOG-GP鉴定  25-26
    2.2.3 M1菌株的G+Cmol％含量  26
    2.2.4 M1菌株16S rDNA PCR扩增和序列同源性比较  26-27
    2.2.5 菌株M1的系统发育分析  27-28
  2.3 讨论  28-29
第三章 产ESH酶的红球菌M1的产酶条件优化  29-34
  3.1 材料和方法  29-30
    3.1.1 培养基和培养条件  29
    3.1.2 顺式环氧琥珀酸水解酶活性和酒石酸含量测定的测定  29
    3.1.3 顺式环氧琥珀酸水解酶酶活性的测定  29
    3.1.4 菌株M1的发酵产酶条件研究  29-30
      3.1.4.1 碳源对菌株M1产酶的影响  29
      3.1.4.2 氮源对菌株M1产酶的影响  29
      3.1.4.3 不同初始pH值对菌株M1产酶的影响  29-30
      3.1.4.4 顺式环氧琥珀酸二钠添加量、添加时间、发酵时间对菌株M1产酶的影响  30
  3.2 结果和分析  30-33
    3.2.1 碳源和氮源对M1菌株产酶的影响  30-32
    3.2.2 顺式环氧琥珀酸二钠的流加对M1产酶的影响  32-33
  3.3 讨论  33-34
第四章 产ESH酶的红球菌M1的细胞固定化研究  34-42
  4.1 材料和方法  34-36
    4.1.1 材料  34
      4.1.1.1 固定化材料  34
      4.1.1.2 底物合成  34
    4.1.2 培养基和培养条件  34
    4.1.3 菌株  34
    4.1.4 固定化细胞的制备方法  34-35
      4.1.4.1 游离细胞的制备  34
      4.1.4.2 固定化细胞的制备  34-35
    4.1.5 复合配方的确定  35
      4.1.5.1 胶体不同配方对固定化菌体特性的影响  35
      4.1.5.2 正交试验  35
    4.1.6 固定化细胞的处理液配方及处理时间确定  35
    4.1.7 固定化细胞反应的稳定性  35
    4.1.8 固定化细胞的活化  35-36
    4.1.9 电镜观察  36
      4.1.9.1 菌株固定前、后的形态观察  36
      4.1.9.2 未加细胞的固定化载体剖面结构电镜照片  36
    4.1.10 分析方法  36
      4.1.10.1 L(+)酒石酸的测定  36
      4.1.10.2 固定化细胞活力测定  36
      4.1.10.3 凝胶强度的测定  36
      4.1.10.4 凝固点的测定  36
  4.2 结果和分析  36-41
    4.2.1 不同配方对固定化细胞凝固温度、强度、活性以及菌体泄漏的影响  36-37
    4.2.2 复合配方正交试验分析  37-38
    4.2.3 固定化细胞后处理正交试验分析  38-39
    4.2.4 固定化细胞的活化  39
    4.2.5 反应的稳定性  39-40
    4.2.6 电镜观察结果  40-41
  4.3 讨论  41-42
第五章 菌株M1产ESH酶的工业发酵研究  42-52
  5.1 材料和方法  42-43
    5.1.1 所用材料  42
      5.1.1.1 底物  42
      5.1.1.2 实验所用设备  42
    5.1.2 培养基和培养条件  42
    5.1.3 顺式环氧琥珀酸水解酶活性测定和酒石酸含量测定的测定  42-43
    5.1.4 菌株M1发酵产酶的逐步放大研究  43
      5.1.4.1 菌株M1在80L罐中的放大研究  43
      5.1.4.2 菌株M1在800L罐中的放大研究  43
      5.1.4.3 菌株M1在5000L罐中的放大研究  43
  5.2 结果和分析  43-51
    5.2.1 菌株M1在80L发酵罐中的生长  43-44
    5.2.2 菌株M1进行800L罐的发酵情况  44-47
      5.2.2.1 800L发酵流程  44
      5.2.2.2 菌株M1在80L种子罐中的培养情况  44-45
      5.2.2.3 补加高pH值的诱导剂对800L发酵产生的影响  45
      5.2.2.4 补加pH值为8.0的诱导剂菌体发酵情况  45-46
      5.2.2.5 优化后800L罐菌体发酵产酶情况  46-47
    5.2.3 菌株M1进行5000L罐的发酵  47-51
      5.2.3.1 800L发酵流程  47
      5.2.3.2 菌株M1在300L种子罐中的培养情况  47-48
      5.2.3.3 按800L放大的规律进行5000L发酵放大后的情况  48-49
      5.2.3.4 5000L发酵培养中期再次补加pH 12的诱导剂对产酶的影响  49-50
      5.2.3.5 优化后5000L发酵罐菌体发酵产酶  50-51
  5.3 讨论  51-52
第六章 产ESH酶的红球菌M1的细胞固定化工业放大研究  52-55
  1 材料和方法  52-53
    1.1 材料  52
    1.2 实验所用设备  52
    1.3 顺式环氧琥珀酸水解酶活性测定和酒石酸含量测定的测定  52
    1.4 游离细胞的制备  52
    1.5 固定化配方  52
    1.6 混合方法  52-53
  2 固定化细胞制备  53
    2.1 固定化细胞流程  53
    2.2 准备工作  53
    2.3 细胞固定及其后处理  53
    2.4 固定化细胞上柱反应  53
      2.4.1 上柱循环  53
      2.4.2 循环条件  53
  3 结果与分析  53-54
  4 讨论  54-55
研究结论与建议  55-58
  一、 研究结论  55-56
    1 、 筛选到一株产ESH酶的红球菌  55
    2 、 二次补加诱导剂与有机氮源提高了酶活  55
    3 、 本文采用卡拉胶-魔芋多糖-羧甲基纤维素钠复合体系进行细胞固定化的研究  55-56
  二、 关于进一步工作的建议  56-58
    1 、 致力于高酶活菌株的获得  56
    2 、 继续优化产酶工艺  56
    3 、 固定化细胞技术的优化  56
    4 、 开展关于ESH酶性质的研究  56-58
英文摘要  58-60
参考文献  60-62
硕士研究生期间论文发表及获奖情况  62

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中图分类: > 工业技术 > 化学工业 > 其他化学工业 > 发酵工业 > 酶制剂（酵素）
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