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体外诱导骨髓基质干细胞向肾小管上皮细胞转分化后功能测定及黄芪干预的实验研究

作　者: 张丽
导　师: 朱晓玲
学　校: 浙江中医药大学
专　业: 中西医结合
关键词: 细胞 转分化 功能 共培养 黄芪 小鼠
分类号: R285.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 27次
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内容摘要


目的探讨骨髓基质干细胞(Bone Marrow Stromal Stem Cells, BMSCs)在体外特定环境中诱导分化为肾小管上皮细胞(Renal Tubular Epithelial Cells, RTECs)后是否具有部分RTECs的功能,为BMSCs的临床应用提供实验依据,观察中药黄芪对其转分化后功能的影响。方法①体外分离培养及鉴定BALB/C小鼠BMSCs和RTECs。②夹闭双侧肾动脉法建立小鼠肾脏急性缺血再灌注损伤(AIRI)模型并鉴定。③将BMSCs分别与正常小鼠及AIRI模型小鼠的RTECs进行体外非接触共培养,并加用中药黄芪进行诱导干预。④共培养诱导后,通过免疫组化鉴定BMSCs是否转分化为RTECs,定量PCR检测各组BMSCs血管紧张素Ⅱ受体(AngⅡ)和内皮素-1(ET-1)的基因表达水平,生化仪测定诱导后BMSCs对尿素氮及尿酸的转运水平,从而了解BMSCs是否发生了向RTECs的转分化并具有部分RTECs的功能。结果①BMSCs接种初期可见大量悬浮细胞,24小时后显微镜下观察可见部分细胞开始贴壁生长,呈单个分散存在或形成数个细胞克隆,传至第三代,细胞纯化,形态较为单一,呈长梭形贴壁生长,以平行排列生长为主或呈漩涡状生长,流式细胞术鉴定BMSCs的CD29表达呈强阳性,CD45、CD34、ClassⅡ表达呈阴性。②小鼠AIRI后肌酐、尿素氮开始升高,并于24h时达高峰,肾脏病理呈现急性肾小管坏死表现。③诱导结束后,BMSCs表达RTECs特异性标志蛋白CK18,而Vimentin和a-SMA表达下降；定量PCR检测BMSCs的AngⅡ受体及ET-1基因表达水平明显增加,黄芪诱导组亦增加；生化检测BMSCs对尿素氮转运作用无显著改变,而对尿酸的转运功能明显提高,黄芪诱导组最为明显。结论BMSCs可以在体外进行分离、培养、扩增；无创伤血管夹夹闭小鼠双侧肾动脉的方法可以成功建立小鼠肾脏AIRI模型；RTECs与BMSCs体外共培养能诱导BMSCs向其转分化,并具有RTECs的部分功能；中药黄芪在BMSCs体外转分化中有促进作用。

全文目录


中文摘要  5-6
ABSTRACT  6-8
前言  8-9
一、材料与方法  9-18
  (一) 实验材料  9-10
    1. 实验动物  9
    2. 实验药品  9
    3. 主要设备与仪器  9-10
    4. 实验试剂  10
  (二) 实验方法  10-18
    1. 主要试剂及配置  10-11
    2. 实验方法  11-15
    3. 实验分组  15
    4. 聚合酶链式反应  15-17
    5. 流式细胞术  17-18
    6. 免疫组化  18
    7. 诱导后BMSCs尿素氮及尿酸的转运功能测定方法  18
    8. 数据统计  18
二、实验结果  18-24
  (一) BMSCs的培养及鉴定  18-19
    1. BMSCs的体外培养  18-19
    2. 流式细胞术鉴定  19
  (二) 小鼠肾脏AIRI模型鉴定  19
    1. 小鼠肾脏AIRI后Scr、BUN测定结果  19
    2. 病理形态改变  19
  (三) RTECs的原代培养及鉴定  19-20
    1. RTECs的体外培养  19-20
    2. 免疫组化鉴定  20
  (四) 诱导后BMSCs鉴定与功能检测  20-24
    1. 免疫组化法检测诱导后BMSCs CK18、Vimentin和α-SMA蛋白的表达  20-21
    2. 定量PCR检测诱导后BMSCs Endothelin、Angiotensin mRNA表达  21
    3. 诱导后BMSCs的尿素氮和尿酸转运功能检测  21-24
三、分析与讨论  24-29
四、结论  29-30
参考文献  30-33
附图  33-38
致谢  38-39
文献综述  39-45
  参考文献  43-45

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中图分类: > 医药、卫生 > 中国医学 > 中药学 > 中药药理学 > 中药实验药理
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