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应用GST Pull-Down实验验证NF-κB相互作用多肽

作　者: 李生茂
导　师: 梁华平
学　校: 第三军医大学
专　业: 外科学
关键词: 核因子-(B(NF-κB) p50 p65 多肽表达 GST Pull-Down 蛋白间相互作用
分类号: R346
类　型: 硕士论文
年　份: 2004年
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内容摘要

核因子-(B(NF-κB)是一种普遍存在的转录因子,它在免疫应答、炎症反应、病毒复制、细胞凋亡和增殖等多种细胞活动中起关键的作用。研究表明,NF-κB可高效诱导60多种细胞因子、粘附分子、趋化因子和急性期反应蛋白的基因表达,同时对参与炎症反应放大与延续的多种酶的基因表达也具有重要的调控作用。此外,肿瘤、自身免疫性疾病、慢性炎性相关性疾病、某些神经性疾病、变态反应以及机体对移植物的排异反应等疾病的发生、发展均与NF-κB的过度活化有着密切关系。因此,多数学者最近提出NF-κB是极具潜力的新型抗炎靶点。从理论上讲,如能有效拮抗NF-κB的活化,则可达到一定程度地缓解或/和治疗炎性相关疾病的目的。本实验小组选择NF-κB与DNA顺式元件相结合这一特异性环节为突破口,以p65亚基的DNA结合域和p50的保守结构域为“诱饵”,已经利用酵母双杂交技术从一16肽随机肽库中筛选出5条与NF-κB p65亚基的DNA结合域结合,9条与p50保守结构域结合的多肽。但是,用酵母双杂交技术筛选与靶蛋白相互作用的多肽,其实验结果可能存在着一定的假阳性,必须用其它的实验做进一步的验证。另外,通过对多肽的序列进行分析后发现,我们获得的多肽疏水性较强,直接应用多肽合成仪合成存在一定的困难。为了获得特异性地与NF-κB相互作用的可溶性多肽,本课题拟用GST Pull-down实验在体外对酵母双杂交技术筛选获得的14条多肽作进一步鉴定,为获得靶向NF-κB的功能拮抗多肽工作奠定基础。本课题进行了以下工作:1. GST-多肽融合蛋白原核表达质粒的构建。PCR法扩增多肽 cDNA,将其构建到有GST标记的原核表达载体pET-42a(+)质粒中,与GST基因构成融合基因,并保持靶基因的阅读框不变。PCR及酶切鉴定正确,DNA测序结果表明,重组质粒中多肽 cDNA碱基序列和阅读框均正确,重组质粒成功,命名为pET42a/PP1、pET42a/PP2、…、pET42a/PP14。2. GST-多肽融合蛋白的原核表达。将重组质粒pET42a/PP1-14转化入蛋白酶缺陷的大肠杆菌BL-21中,在低温下(30℃)IPTG(0.4mM)诱导4hr,SDS-PAGE检测蛋白表达,发现有可溶的GST-多肽融合蛋白<WP=11>表达,分子量约为31kDa,表达量约占菌体总蛋白的8%,再依此条件大量诱导表达,并将可溶蛋白用谷光甘肽-琼脂糖树脂进行免疫亲和纯化,得到可溶的纯度较高的GST-多肽融合蛋白。3. NF-κB p50,P65亚基保守结构域cDNA 原核表达质粒的构建。(1)用PCR法扩增NF-κB p50,P65亚基保守结构域cDNA,大小分别为1104bp和999bp。(2)将NF-κB p50,P65亚基保守结构域cDNA用pUCm-T 载体做T-A亚克隆,进行蓝白斑筛选,PCR、酶切鉴定正确后,命名重组质粒为:pUCm-T/p50, pUCm-T/p65。(3)用内切酶将pUCm-T/p50, pUCm-T/p65消化,回收目的片断,跟用相同内切酶消化的pET-22b(+)载体连接,用氨苄青霉素筛选,将重组子质粒用PCR法和酶切鉴定,进一步测序结果表明,重组质粒中插入cDNA碱基无突变,阅读框正确,重组质粒成功,命名为pET22b/p50、pET22b/p65。4. p50和P65蛋白的原核表达、包涵体的变性复性及其DNA结合活性的检测。(1) 将 pET22b/p50、pET22b/p65质粒转化入大肠杆菌表达菌株BL-21中,在低温下(30℃)IPTG(0.4mM)诱导4hr,SDS-PAGE电泳、Western-Blot 检测鉴定蛋白表达;p50和p65蛋白均以包涵体形式表达,分子量分别为44kDa和40kDa,表达量分别约占菌体蛋白的30.2%和24.2%。(2) 大量表达p50和p65蛋白后,将包涵体蛋白进行纯化、尿素法变性复性处理,得到可溶的蛋白,浓度分别为218μg/ml和158μg/ml;并用EMSA法证实可溶的p50和p65蛋白均具有DNA结合活性。5. 用GST Pull-down体外实验鉴定多肽蛋白与p50和p65蛋白间的相互作用。将GST-多肽融合蛋白固化在谷胱甘肽亲和树脂上,充当诱饵蛋白,再用p50和p65的表达液过柱,通过蛋白间相互作用,分别捕获p50和p65蛋白,洗脱后用SDS-PAGE、考马斯亮蓝染色鉴定多肽与p50和p65的相互作用,并证实其中有3条多肽(6,9,13号)与p50亚基有特异的物理性相互作用。

应用GST Pull-Down实验验证NF-κB相互作用多肽

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