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OX40配体在小鼠组织和内皮细胞表达的研究

作　者: 王飞
导　师: 杨笛
学　校: 南京医科大学
专　业: 内科学
关键词: 小鼠 OX40 mRNA表达蛋白表达
分类号: R543.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

背景动脉粥样硬化斑块的发生、发展,斑块由稳定状态演变成不稳定及破裂,涉及到脂质代谢异常、炎症反应、内皮功能受损、遗传等众多因素,其具体机制尚待阐明。共刺激分子OX40配体(OX40L/CD134L/gp34),是参与T细胞活化的辅助性分子,是肿瘤坏死因子(TNF)家族成员之一。OX40L主要表达在活化的抗原递呈细胞表面,如树突状细胞、B淋巴细胞、巨噬细胞,以及血管内皮细胞中。逆向信号通路是共刺激分子的重要特征,即除了配体/受体的正向信号,受体也可通过配体传递逆向信号。在斑块部位OX40L表达增高,OX40与OX40L的结合可诱导人脐静脉内皮细胞c-jun基因表达上调、趋化因子RANTES/CCL5表达增高,直接介导T细胞或OX40+T细胞向内皮细胞黏附。研究发现C57BL/6小鼠对动脉粥样硬化具有易感性,而C3H/ He和BALB / c的小鼠对动脉粥样硬化不易感,经过数量性状座位筛查出第一个动脉粥样硬化的易感基因区域, OX40L基因就位于该区域。这些研究显示OX40L在动脉粥样硬化的形成和发展中可能起到重要作用。内皮功能受损不仅是斑块发生的始动环节,而且加速斑块生长、解除内皮对高危斑块的保护,内皮功能的严重受损是斑块急性炎症反应的诱发因素之一。C反应蛋白(CRP)是动脉粥样硬化的炎症标志物之一,参与动脉粥样硬化的致炎过程。本实验室前期研究显示CRP可引起心肌细胞损伤,循环中受炎症因子刺激升高的CRP是否影响到内皮细胞OX40L的表达和信号通路,尚待研究。目的本论文通过观察动脉粥样硬化易感小鼠C57BL/6和不易感小鼠BALB/c心脏、肾脏、脑、骨骼肌以及脾脏等组织中OX40L基因和蛋白表达差异,CRP对小鼠主动脉内皮细胞OX40L表达的作用,探讨OX40L在动脉粥样硬化斑块形成和发展中的可能作用机制。内容与方法1. 8周龄正常雄性C57BL/6小鼠和BALB/c小鼠各8只,平均体重22克。提取小鼠心脏、脑、肾脏、骨骼肌和脾脏总mRNA和总蛋白,采用RT-PCR和Western Blot的方法分别检测OX40L的mRNA和蛋白表达水平。2.应用亲和层析柱从感染、炎症期及肿瘤患者胸水中分离、纯化CRP,电泳和Western Blot鉴定。3.采用酶消化培养法原代培养小鼠主动脉内皮细胞,用内皮细胞特异性抗体VWF抗体鉴别小鼠主动脉内皮细胞。待小鼠主动脉内皮细胞密度长至60～70%时,用100ug/ml CRP干预内皮细胞,48小时后提取内皮细胞总mRNA和总蛋白,用RT-PCR和Western Blot方法检测内皮细胞OX40L和蛋白表达水平,重复3次。结果1. C57BL/6小鼠的心脏OX40L的mRNA表达水平显著高于BALB/c小鼠(0.79±0.10 vs 0.60±0.05, P <0.05,n=8);脑、肾脏和骨骼肌mRNA表达水平在两个品系小鼠间无明显差异;BALB/c小鼠脾脏OX40L的mRNA表达显著高于C57BL/6小鼠(0.39±0.17 vs 0.25±0.04, P <0.05,n=8);C57BL/6小鼠的心脏、脑和肾脏OX40L蛋白表达水平表达较BALB/c小鼠显著增高(0.56±0.01 vs 0.19±0.07,0.18±0.07 vs 0.01±0.01,0.31±0.13 vs 0.03±0.01,P<0.05,n=8),骨骼肌和脾脏OX40L蛋白的表达水平两种品系小鼠之间无显著差异。2.纯化的CRP电泳分析纯度达95%以上,Western Blot显示纯化的CRP与CRP抗体特异性结合。3.用纯化的100ug/ml的CRP与小鼠主动脉内皮细胞共孵育48小时后,干预的内皮细胞OX40L的mRNA和蛋白质表达较未干预细胞显著增高(0.09±0.04 vs 0.76±0.12,P<0.05;0.07±0.02 vs 0.21±0.06,P<0.05,n=3)。结论OX40L在正常动脉粥样硬化易感C57BL/6小鼠和不易感BALB/c小鼠的心脏、脑、肾脏、骨骼肌和脾脏组织中基因和蛋白表达水平存在差异。CRP可诱导小鼠主动脉内皮细胞OX40L表达增高,提示OX40L可能在动脉粥样硬化中发挥作用。

全文目录

中文摘要  4-7
ABSTRACT  7-10
第一部分OX40L在BALB/C和C578L/6 小鼠组织表达差异的研究  10-24
  引言  10-11
  材料和方法  11-17
  结果  17-20
  讨论  20-22
  小结  22
  参考文献  22-24
第二部分 CRP对小鼠主动脉内皮细胞OX40L表达的影响  24-44
  第一节 CRP的纯化与鉴定  24-34
    引言  24-25
    材料和方法  25-28
    结果  28-29
    讨论  29-30
    小结  30
    参考文献  30-34
  第二节 CRP对小鼠主动脉内皮细胞OX40L表达的影响  34-44
    引言  34-35
    材料和方法  35-39
    结果  39-40
    讨论  40-41
    小结  41
    参考文献  41-44
文献综述  44-54
  参考文献  49-54
附录一：发表文章  54-55
附录二：缩略语  55-57
致谢  57

OX40配体在小鼠组织和内皮细胞表达的研究

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