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利用转基因技术进行耐盐基因转化花生的研究

作　者: 曹军
导　师: 庄东红
学　校: 汕头大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 花生转基因农杆菌花粉管通道法二对D基因秋茄海边月见草耐盐
分类号: S565.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2004年
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内容摘要

土壤盐渍化是影响农业生产和生态环境的严重问题。据联合国环境组织报道全球约有50％的耕地受到盐胁迫危害。我国也有大面积的盐碱地，仅海岸带、滩涂地就达一亿多亩，并且有逐年增加的趋势。面对人口不断增加、耕地日趋减少和淡水资源严重不足的现实，如何利用大面积的盐碱地和丰富的海水资源，这是人类迫切需要解决的重大课题。随着生物技术的发展，人们寄希望于基因工程育种，即通过直接导入耐盐基因，使转基因作物获得耐盐性，实现在盐碱地或海滩上用海水浇灌种植农作物的梦想。本论文研究选用已在模式植物中证实能增强耐盐性的mtlD（mannitol-1-phosphate dehydrogenase）基因及生长在海滩上的具有酬盐碱等特性的盐生植物-秋茄（Kandelia candel L. Druce）和海边月见草（Oenothera littaralis Schlect）的总DNA作为目的基因，通过根癌农杆菌介导法和花粉管通道法转化优良栽培花生品种（Arachis hypogaea L. cv. Shanyou 523），以期获得转基因耐盐花生。本研究是国内外首次进行单个耐盐基因和盐生植物总DNA转化花生的研究。主要结果如下： 1．建立了根癌农杆菌介导mtLD基因导入化生的遗传转化体系。整个遗传转化过程主要分为预培养、共培养、诱芽、促芽、生根及移栽六个步骤。取萌发7～8 d的花生叶片，切取中段为外植体，在诱芽培养基（MS+0.8 mg／L NAA+3 mg／L 6-BA+2 mg／L AgNO₃+6 mg／L GLutamine+30 g／L Sucrose+0.7％Agar，pH 5.8）上预培养3d，然后在农杆菌菌液中浸泡5 min，放在诱芽培养基上共培养2 d，再用含有500 mg／L羧苄青霉素的无菌蒸馏水冲洗后，置于添加了500 mg／L羧苄青霉素和80 mg／L新霉素的诱芽培养基上进行选择培养，直到长出幼芽（大约5 w）。转入添加了500mg／L羧苄青霉素和80 mg／L新霉素的促芽培养基（MS+3 mg／L6-BA+2 mg／L AgNO₃+30 g／L Sucrose+0.7％ Agar，pH 5.8）中培养，3 w后将长出的小苗转移至生根培养基（MS+0.8 mg／L NAA+2 mg／L AgNO₃+30 g／L Sucrose+0.7％Agar，pH 5.8），大约2 w后将长出强壮根系的植株移栽到沙土中。 2．通过根癌农杆菌介导mtlD基因转化花生共获得57个再生植株。提取这些植株的叶片DNA进行PCR反应，然后对PCR产物进行Southern杂交分析。结果有3株转化植株在PCR反应中能产生1.1 kb大小的预期DNA片段，而且该片段可与mtlD汕头大学硕士学位论文基因探针进行特异性杂交，基因己整合进花生基因组中而l泪性对照植株没有此预期DNA片段产生，表明。t1D本次实验的转化率为5.3%。花粉管通道介导。t1D基因转化花生的研究。在2001年秋季获得“汕油523”T.，代转化植株共29株，I>CR检测到2株阳性柏株，均为100卜g/m1的DNA处理浓度和花警管注射法处理，转化率为5.9%。由这2株}‘日性植株共繁殖了22株T，代植株，捉取它们fl勺l矛}·，}t)N八分别进行}’CtZ反应，少1又、Jj，Ct丈产物进行Southern杂交分析的结果，其中一株的后代（共9株）尸C尺产物都没有产生预期大小的DNA片段，而另一株的后代（共13株）中有4株在PCI{反应中能产生1.1 kb大小的预期DNA片段，而且该片段可与刃叮D基因探针进行特异性杂交。进一步对这4株花生的后代（T它代，共21株）进行PCR检测，其中有7株呈阳性。这表明经花粉管通道介导转化的二洲D基因已整合进花生基因组中，并己初步获得稳定遗传。转基因花生种子（}’:代）在l月0 mmol/IJ NaCI溶液处王‘}‘一卜}’}勺发芽率比对照提高21.9%。花粉管通道介导秋茄总ONA和海边月见草总I)触转化花生的研究。转基因花生种子门’:代)在1斗0 mm。1/L NaCI溶液处理卜‘的发芽率有明显的提高。与对照相比，转秋茄总洲A花生和转海边月见草总0入八花生的发芽率分别提高了31.8%、28.4%。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-8
一前言  8-17
  1 植物耐盐胁迫基因工程研究进展  8-14
  2 花生转基因研究现状  14-16
  3 本论文的研究内容、目的及意义  16-17
二根癌农杆菌介导mtlD基因转化花生  17-30
  1 材料与方法  17-22
  2 结果  22-25
    2.1 根癌农杆菌的转化和鉴定  22
    2.2 新霉素对花生幼叶芽诱导及再生苗生根的影响  22-23
    2.3 NaCl对花生幼叶芽诱导的影响  23-24
    2.4 根癌农杆菌介导的花生遗传转化和植株的再生  24
    2.5 再生植株的PCR-Southern杂交检测  24-25
  3 讨论  25-30
    3.1 关于冻融法转化农杆菌及其鉴定  25-26
    3.2 新霉素对花生幼叶芽诱导及再生苗生根的影响  26-27
    3.3 NaCl对花生幼叶芽诱导的影响  27
    3.4 转基因花生的检测  27-29
    3.5 根癌农杆菌介导的花生转化率  29-30
三花粉管通道介导mtlD基因、秋茄和海边月见草总DNA转化花生  30-50
  1 材料与方法  30-33
  2 结果  33-43
    2.1 花生花粉的离体萌发  33-34
    2.2 外源DNA的纯度与浓度  34-35
    2.3 外源DNA导入时间的确定  35
    2.4 转mild基因花生的获得与鉴定  35-37
    2.5 转milD基因花生的遗传  37-38
    2.6 转基因操作对花生生长的影响  38-40
    2.7 转基因花生后代的芽期耐盐性  40-41
    2.8 花生“汕油523”在盐胁迫下应激反应的初步研究  41-43
  3 讨论  43-50
    3.1 花粉管通道介导的基因转化技术  43-45
    3.2 蔗糖和硼酸对花生花粉萌发的影响  45
    3.3 影响花粉管通道法转化效率的因素  45-46
    3.4 转基因花生的遗传  46-47
    3.5 转基因操作对花生的影响  47
    3.6 转基因花生后代的耐盐性  47-48
    3.7 花生“汕油523”在盐胁迫下应激反应的初步研究  48-50
参考文献  50-59
致谢  59-61

利用转基因技术进行耐盐基因转化花生的研究

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