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乙醇生物标志性代谢物的检测及动力学研究

作　者: 赵晖
导　师: 卓先义
学　校: 复旦大学
专　业: 法医学
关键词: 乙基葡萄糖醛酸苷代谢动力学气-质联用液-质联用 LTQ-Orbitrap
分类号: D919.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

我国酒文化源远流长,因饮酒引发的事故和案件已经成为严重的社会问题。涉及酒精的技术鉴定,如酒后驾驶或醉酒驾驶的认定、酒后肇事逃逸的认定、尸体中酒精来源的判定等,是司法鉴定工作中经常面临的问题。乙醇进入人体后,摄入量的95%-98%经肝代谢,先被氧化为乙醛,再进一步被氧化为乙酸；其余的部分(2%-5%)主要以原体形态由尿液、呼气和汗液中排出体外；仅有微量乙醒(<0.1%)与尿嘧啶核苷-5’-二磷-葡萄糖醛酸结合,生成乙基葡萄糖醛酸苷(Ethyl Glucuronide,Et(?)G)从样中排出体外；同时有微量乙醇在肝脏中代谢成乙基硫酸酯(Ethyl Sulphate, EtS),由尿液中排出体外。由于乙基葡萄糖醛酸苷和乙基硫酸酯在体内可停留时间比其原体乙醇长,近年来越来越为人们所重视,被认为是乙醇的标志性化合物。在酒后驾车事故,特别是肇事逃逸案件中,当血液中测不出乙醇时,只要检出一定量的乙基葡萄糖醛酸苷和乙基硫酸酯,也可认为是酒后驾车或生前摄入乙醇。有关乙基葡萄糖醛酸苷的检测及体内代谢动力学国外已有一些报道,国内尚未有相关研究报道。本学位论文以乙基葡萄糖醛酸苷为主要研究对象,致力于建立血液和尿液中乙基葡萄糖醛酸苷的定性、定量分析方法,并对方法的检出限、回收率、线性范围等作出评价；利用健康自愿受试者控制剂量饮酒后,定时测定其血液和尿液中乙基葡萄糖醛酸苷浓度,考察中国人体内乙基葡萄糖醛酸苷的代谢动力学；确定中国人酒后乙基葡萄糖醛酸苷的检出时限；初步实现了利用血液中EtG和乙醇浓度关系,推定饮酒时间的数据建模。全部内容按照工作展开的时间顺序分为六章。第一章介绍了国内外EtG分析研究进展和应用,阐述了本研究的研究背景、意义和主要工作。第二章建立和评价了气相色谱-串联质谱联用仪(GC-MS/MS)测定血液中EtG的方法。该方法血液中EtG的检出限(LOD)为0.05μg/mL,线性范围为0.1μg/mL-10μg/mL (R2=0.9999),准确度为90%-110%,日内精密度和日间精密度均小于15%,并成功应用于实际案例的检测。第三章建立和评价了液相色谱-线性离子阱-轨道离子阱(LC-LTQ-Orbitrap)测定血液、尿液中EtG的方法。该方法血液、尿液中EtG的检测限均为0.02μ/mL,线性范围为0.05-5.00μg/mL (R2>0.998),两基质中EtG检测方法的日内准确度与日间准确度均为85%-110%,日内精密度和日间精密度均小于10%。第四章建立和评价了液相色谱-串联质谱联用仪(LC-MS/MS)测定血液、尿液中EtG的方法。该方法血液和尿液中EtG的检测限均为0.05μg/mL,线性范围为0.1μg/mL-5μg/mL (R2>0.999),两基质中EtG检测方法的日内准确度均为95%-105%,日内精密度与日间精密度均小于15%。第五章开展了剂量控制的健康志愿者饮酒实验,采集血液与尿液样本；利用建立的LC-MS/MS方法检测样本,考察EtG的代谢动力学,探讨了血液和尿液中EtG,血液和尿液中的乙醇的相互关系。通过统计软件Stata 7.0计算,EtG在血液浓度峰值为4-6h,检测时限为8-21h,比血液中乙醇检测时限长8-10h。乙醇在EtG在尿液浓度峰值为4-6h,检测时限为20-85h,比尿液中乙醇检测时限长12-70h,并以此初步建立了由EtG和乙醇浓度推算饮酒时间的数据模型。第六章建立了血液、尿液中EtS的LC-LTQ-Orbitrap分析方法。线性范围0.1μg/mL-5μg/mL (R2>0.995)。本研究在国内首次建立了GC-MS/MS、LC-LTQ-Orbitrap和LC-MS/MS等多个EtG检测方法并进行了方法学验证,其中LC-LTQ-Orbitrap方法为国际上首次报道；首次考察中国人酒后乙基葡萄糖醛酸苷的代谢动力学,探讨了血液和尿液中EtG与乙醇的相互关系,提出了EtG在血液、尿液中的检出时限。研究成果为酒后驾驶逃逸者的认定、尸体检材中乙醇来源的判断提供了科学依据。

全文目录

摘要  7-9
Abstract  9-11
第一章前言  11-16
  1.1 乙醇生物标志性代谢物简介  11
  1.2 乙基葡萄糖醛酸苷(EtG)研究概况  11-12
  1.3 研究意义  12-13
  1.4 主要研究内容  13-14
  1.5 取得成果及创新性  14-16
第二章 GC-MS/MS检测血液中的EtG  16-21
  2.1 材料与方法  16-17
    2.1.1 主要仪器  16
    2.1.2 试剂与材料  16
    2.1.3 标准溶液的配置  16
    2.1.4 样品的前处理  16-17
  2.2 仪器条件  17
    2.2.1 气相条件  17
    2.2.2 质谱条件  17
  2.3 结果与讨论  17-21
    2.3.1 EtG GC-MS/MS测定的方法验证  17-19
    2.3.2 实际案例  19-20
    2.3.3 小结  20-21
第三章 LTQ-Orbitrap检测血液、尿液中的EtG  21-34
  3.1 材料与方法  21-22
    3.1.1 主要仪器  21
    3.1.2 试剂与材料  21
    3.1.3 标准溶液的配置  21
    3.1.4 样品的前处理  21-22
  3.2 仪器条件  22
    3.2.1 液相条件  22
    3.2.2 质谱条件  22
  3.3 结果与讨论  22-34
    3.3.1 EtG LTQ-Orbitrap测定条件的优化  22-27
      3.3.1.1 前处理方法优化  22-23
      3.3.1.2 色谱方法优化  23-24
      3.3.1.3 质谱方法优化  24-27
    3.3.2 EtG LTQ-Orbitrap测定的方法验证  27-32
      3.3.2.1 方法选择性  27-29
      3.3.2.2 线性曲线  29-31
      3.3.2.3 精密度与准确度  31
      3.3.2.4 回收率与基质效应  31-32
    3.3.3 小结  32-34
第四章 LC-MS/MS检测血液、尿液中的EtG  34-46
  4.1 材料与方法  34-35
    4.1.1 主要仪器  34
    4.1.2 试剂与材料  34
    4.1.3 标准溶液的配置  34-35
    4.1.4 样品的前处理  35
  4.2 仪器条件  35-36
    4.2.1 液相条件  35
    4.2.2 质谱条件  35-36
  4.3 结果与讨论  36-46
    4.3.1 EtG LC-MS/MS测定条件的优化  36-38
    4.3.2 EtG LC-MS/MS测定的方法验证  38-43
      4.3.2.1 方法专属性  38-40
      4.3.2.2 线性曲线  40-41
      4.3.2.3 精密度与准确度  41
      4.3.2.4 回收率与基质效应  41-42
      4.3.2.5 EtG的体外稳定性  42-43
    4.3.3 方法学小结  43-45
    4.3.4 三种EtG的质谱方法的分析比较  45-46
第五章 EtG的体内代谢动力学研究  46-74
  5.1 实验部分  46-50
    5.1.1 材料与试剂  46
    5.1.2 饮酒实验  46-47
    5.1.3 测定EtG  47
    5.1.4 测定乙醇和肌酐  47-50
    5.1.5 数据统计  50
  5.2 结果与讨论  50-73
    5.2.1 结果判定  50
    5.2.2 血液中的乙醇和EtG  50-61
    5.2.3 尿液中的乙醇和EtG  61-73
    5.2.4 血液、尿液中乙醇的相互关系  73
  5.3 结论  73-74
第六章 LTQ-Orbitrap检测血液、尿液中乙基硫酸酯(EtS)  74-78
  6.1 材料与方法  74-75
    6.1.1 主要仪器  74
    6.1.2 试剂与材料  74
    6.1.3 标准溶液的配置  74
    6.1.4 样品的前处理  74-75
  6.2 仪器条件  75
    6.2.1 液相条件  75
    6.2.2 质谱条件  75
  6.3 方法验证  75-78
    6.3.1 方法专属性  75-76
    6.3.2 线性曲线  76-77
    6.3.3 小结  77-78
结语  78-80
参考文献  80-83
附录1.血液中乙醇的检测作业指导书(第一页)  83-84
附录2.综述:乙基葡萄糖醛酸苷研究进展  84-89
附录3.参与论文  89-92
附录4.会议论文  92-93
致谢  93-94

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