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在线固相萃取技术在高通量药物代谢分析中的应用研究

作　者: 解蕊
导　师: 范国荣
学　校: 第二军医大学
专　业: 药物分析学
关键词: 药物代谢动力学高效液相色谱法在线固相萃取技术自制富集柱分析短柱 Beagle犬蛋白沉淀血浆尿液法罗培南硫酸氢头孢地尼钠
分类号: R96
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

药物代谢动力学旨在通过测定生物样本中的药物或者代谢产物的浓度,定量描述药物进入体内以后的吸收、分布、代谢、排泄过程,进而阐明药物的药效或者毒性,为新药研究的代谢筛选和临床用药的疗效评价提供重要依据。面对不断涌现的大量候选药物,在进行药效学研究的同时,需要进行药代动力学评价,这就要求建立并优化相关分析方法对生物样品中的目标成分(药物、代谢产物、其他外源性成分)进行高灵敏度、快速准确的定量分析。基于在线固相萃取技术的高通量前处理技术和常规分析短柱的快速分析测定方法,本文构建了“准确、灵敏、简便、高通量”的分析策略,并将其应用到新药药代动力学研究中。一、在线固相萃取技术及分析短柱在药代动力学中的应用进展临床前药代动力学研究包括动物实验、方法学考察和验证、样品前处理、样品分析、数据处理5个方面,其中大部分和分析方法的建立与应用紧密相连。现代分析科学在药代动力学研究中体现出举足轻重的地位,只有建立可靠、专一、灵敏、快速的生物样品分析方法,才能够实现高通量生物样品分析过程,满足药代动力学研究大样本量的要求。本文对在线固相萃取技术的应用以及基于常规分析短柱的快速分析方法的建立进行了综述。详细介绍了在线固相萃取技术的特点,并且对其在药物分析及生物样品测定中的应用进行了一些回顾。对于在生物样品高通量分析中也会经常使用的分析短柱,本文对其特点、优势以及使用注意事项等进行了讨论。根据本实验研究结果认为采用在线固相萃取技术结合分析短柱可以有效提高样品前处理及分析过程中的通量,从而获得准确、灵敏、简便、高通量的生物样品分析方法。二、在线固相萃取技术结合分析短柱在药代动力学中的应用研究本文建立了快速测定人血浆和尿液中法罗培南以及Beagle犬血浆中硫酸氢头孢地尼钠的在线固相萃取-高效液相色谱法,考察了富集柱、富集流动相、切换时间等对在线固相萃取前处理系统的影响,研究了分析短柱在进行生物样品分析时分析柱型号、流动相组成、缓冲液pH值以及流速等对目标成分保留性质的影响。在此基础上将方法成功应用于人血浆和尿液中法罗培南以及Beagle犬血浆中硫酸氢头孢地尼钠的药代动力学研究中。1、针对人血浆中的法罗培南,在线固相萃取采用本教研室自行填制的富集柱,LichrospherC18,25μm,37mm×4.6mm i.d;分析柱为月旭公司UltimteTM C18,5μm,50mm×4.6mm i.d(Welth,美国)色谱柱。富集流动相为20mM的磷酸二氢钠缓冲溶液(磷酸调pH至3.5),使用前经过0.45μm的微孔滤膜过滤,流速为2 ml/min;分析流动相为乙腈-20mM的磷酸二氢钠缓冲溶液(磷酸调pH至3.5)=16:84,使用前经过0.45μm的微孔滤膜过滤,流速为1.5ml/min;两柱柱温均为30℃,进样量是100μl,紫外检测波长为318nm。为了延长富集柱的使用寿命,采用了预先蛋白沉淀法作为保护措施。100μl血浆样品用6%高氯酸进行蛋白沉淀后再进入富集柱进行前处理,结果显示法罗培南和内标加替沙星的保留时间分别为3.3和4.2min,生物样品内源性物质不干扰目标成分的测定,每个样品分析周期为5min。与以往方法相比,此法在常规液相色谱分析法的基础上提高了样品分析速度,检测灵敏度也得到了提高。针对人尿液中的法罗培南,在线固相萃取前处理部分以及样品分析部分均与分析人血浆中的法罗培南一致。为了延长富集柱的使用寿命,采用了预先稀释离心法作为保护措施。50μl尿液样品离心稀释后再进入富集柱进行前处理,结果显示法罗培南和内标加替沙星的保留时间分别为3.3和4.2min,生物样品内源性物质不干扰目标成分的测定,每个样品分析周期为5min。与以往方法相比,该方法在常规液相色谱分析法的基础上提高了样品分析通量,而且检测灵敏度也得到了提高。2、针对新药硫酸氢头孢地尼钠的临床前药代动力学研究的要求,实验设计分为两部分:⑴Beagle犬单剂量口服给药硫酸氢头孢地尼钠胶囊和不同剂量市售头孢地尼胶囊进行药代动力学研究以及高剂量头孢地尼暴露水平的安全性研究;⑵Beagle犬静脉注射给药头孢地尼注射液(临用前新配,将头孢地尼标准对照品用pH=7.0的磷酸盐缓冲溶液溶解即得),按10mg/犬剂量在Beagle犬后肢静脉注射给药,进行绝对生物利用度研究。给药方法:⑴试验采用自身对照、随机交叉试验方法,选择三制剂三周期的3×3拉丁方设计,即6条成年、健康Beagle犬随机分成三组,每组2条,即硫酸氢头孢地尼钠胶囊(A药)受试组、头孢地尼胶囊(B药)对照组、高剂量头孢地尼(C药)暴露组。对照组口服给药头孢地尼胶囊100mg/犬,受试组口服给药硫酸氢头孢地尼钠胶囊100mg/犬(以有效成分头孢地尼计),暴露组口服给药头孢地尼胶囊300mg/犬(高剂量头孢地尼给药选择以临床3倍常规剂量计)。⑵选择6条成年、健康Beagle犬,于后肢静脉注射给药头孢地尼10mg/犬。给药后于不同时间点取血,测定血浆中头孢地尼的浓度,根据所得的血浆药物浓度-时间曲线,采用非房室模型分别估算药代动力学参数,并采用方差分析和双单侧t检验进行统计分析,为下一步的临床研究提供参考依据。对新药硫酸氢头孢地尼钠的分析,在线固相萃取采用本教研室自行填制的富集柱,LichrospherC18,25μm,37mm×4.6mm i.d;分析柱为月旭公司UltimteTM C18,5μm,50mm×4.6mm i.d(Welth,美国)色谱柱。富集流动相为20mM的磷酸二氢钾缓冲溶液(磷酸调pH至3.0),使用前经过0.45μm的微孔滤膜过滤,流速为2ml/min;分析流动相为甲醇-乙腈-20mM的磷酸二氢钾缓冲溶液(磷酸调pH至3.0)=11.25:6.75:82,使用前经过0.45μm的微孔滤膜过滤,流速为1.5ml/min;两柱柱温均为30℃,进样量是100μl,紫外检测波长为286nm。为了延长富集柱的使用寿命,采用了预先蛋白沉淀法作为保护措施。50μl血浆样品用6%高氯酸进行蛋白沉淀后再进入富集柱进行前处理,结果显示头孢地尼和内标诺氟沙星的保留时间分别为2.3和3.3min,生物样品内源性物质不干扰目标成分的测定,每个样品分析周期为4min。该方法为新药硫酸氢头孢地尼钠的血药浓度监测提供了值得借鉴的高通量分析方法。

在线固相萃取技术在高通量药物代谢分析中的应用研究

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