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快速检测猪繁殖与呼吸综合征病毒免疫胶体金诊断试纸条的研制

作　者: 周盛华
导　师: 崔尚金
学　校: 东北农业大学
专　业: 基础兽医学
关键词: 猪繁殖与呼吸综合征病毒 免疫胶体金诊断试纸条 McAb
分类号: S854.43
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
下　载: 275次
引　用: 2次
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内容摘要


猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)属于动脉炎病毒科(Arteriviridae),动脉炎病毒属(Arterivirus),可引起怀孕母猪流产、早产及断奶仔猪肺炎、生长迟缓等症状,给养猪业带来严重经济损失。因此,建立能够对PRRSV进行现地快速检测的、简便的诊断方法是十分必要的。本试验采用差速离心和蔗糖密度梯度离心法纯化病毒抗原,按常规方法免疫BALB/c小鼠,利用杂交瘤细胞技术融合小鼠脾细胞与SP2/0细胞,融合率为91.4%。用建立间接ELISA方法检测杂交瘤细胞上清,结果阳性率为20.6%。采用有限稀释法进行3次克隆,获得了5株抗PRRSV单克隆抗体(McAb),分别命名为D5、D7、D10、E9和B5。5株McAb腹水的效价分别为1:25600、1:12800、1:6400、1:12800和1:6400。免疫球蛋白亚类鉴定结果显示,D5和B5属于IgG2b亚类,D7、D10和E9属于IgM亚类,而其轻链均为κ链。用原核表达的PRRSV N蛋白对家兔进行多次免疫,制备了兔抗PRRSV N蛋白抗体。免疫胶体金诊断试纸条具有快速、简便等优点,结合单克隆抗体技术又有良好的特异性和敏感性,是目前现地应用最广泛的一种诊断方法。本试验利用柠檬酸三钠还原法制备粒径约为20nm的胶体金,选择抗体效价高,反应活性好且亚类为IgG2b的D5 McAb与20nm的胶体金颗粒结合制备探针,同时将纯化的兔抗PRRSV N蛋白抗体和羊抗鼠IgG包被硝酸纤维素膜(NCM)分别作为检测线(T线)和质控线(C线),组装成检测PRRSV的免疫胶体金诊断试纸条。敏感性试验结果表明,本试验组装的免疫胶体金诊断试纸条可以检出6.25μg/mL纯化的PRRSV抗原。在特异性试验中,用所组装的试纸条对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)和猪细小病毒(PPV)进行检测,结果显示,该试纸条只能够检测出PRRSV为阳性,其余均为阴性。在现地试验中,对30份样本进行检测,结果显示,本试验组装的免疫胶体金诊断试纸条检出19份阳性病料,而RT-PCR方法检出21份阳性病料,总符合率为90.0%;阳性符合率为90.5%;阴性符合率为88.9%。

全文目录


摘要  10-11
Abstract  11-13
1 引言  13-20
  1.1 猪繁殖与呼吸综合征病毒病原学  13-15
    1.1.1 分类地位  13
    1.1.2 形态特征  13
    1.1.3 理化特性  13
    1.1.4 培养特性  13-14
    1.1.5 分子生物学特性  14
    1.1.6 遗传变异  14-15
    1.1.7 致病机理  15
  1.2 PRRSV 的检测方法  15-16
    1.2.1 病毒的分离与鉴定  15
    1.2.2 免疫组织化学法  15-16
    1.2.3 聚合酶链反应（PCR）技术  16
    1.2.4 核酸探针原位杂交技术（ISH）  16
  1.3 免疫胶体金快速诊断技术的应用  16-18
    1.3.1 免疫胶体金诊断试纸条基本原理  17
    1.3.2 免疫胶体金诊断试纸条的优点  17-18
    1.3.3 免疫胶体金诊断试纸条在猪病诊断上的应用  18
  1.4 课题研究的背景与意义  18
  1.5 研究内容及技术路线  18-20
    1.5.1 研究内容  18-19
    1.5.2 技术路线  19-20
2 材料与方法  20-29
  2.1 材料  20
    2.1.1 病毒与细胞  20
    2.1.2 实验动物  20
    2.1.3 主要试剂  20
    2.1.4 主要仪器及耗材  20
  2.2 方法  20-29
    2.2.1 抗PRRSV McAb 的制备  20-24
    2.2.2 兔抗PRRSV N 蛋白抗体的制备  24-25
    2.2.3 免疫胶体金诊断试纸条的组装  25-26
    2.2.4 免疫胶体金诊断试纸条反应条件的优化  26-28
    2.2.5 免疫胶体金诊断试纸条的性能测试  28-29
3 结果与分析  29-40
  3.1 抗PRRSV McAb 制备结果  29-34
    3.1.1 PRRSV 抗原的制备  29
    3.1.2 间接ELISA 检测方法最佳工作条件的建立  29-30
    3.1.3 小鼠抗体水平检测  30
    3.1.4 细胞融合与筛选  30-31
    3.1.5 腹水的制备与纯化  31
    3.1.6 McAb 的特性鉴定  31-34
  3.2 兔抗PRRSV N 蛋白抗体制备结果  34-35
  3.3 免疫胶体金诊断试纸条的组装结果  35-38
    3.3.1 胶体金颗粒的质量  35
    3.3.2 McAb 最适标记量的测定  35-36
    3.3.3 抗体标记反应时间的确定  36
    3.3.4 金标McAb 稳定剂的选择  36
    3.3.5 金标McAb 包被量确定  36-37
    3.3.6 NCM 抗体包被量的确定  37-38
    3.3.7 结合垫封闭液的选择  38
    3.3.8 样品垫封闭液的选择  38
    3.3.9 NCM 封闭液的选择及浓度确定  38
  3.4 免疫胶体金诊断试纸条性能测试结果  38-40
    3.4.1 特异性试验  38-39
    3.4.2 敏感性试验  39
    3.4.3 保存期  39
    3.4.4 现地样本的检测  39-40
4 讨论  40-44
  4.1 关于抗PRRSV McAb 的制备  40-41
    4.1.1 抗原的制备与动物免疫  40
    4.1.2 细胞融合  40-41
    4.1.3 杂交瘤细胞株筛选  41
    4.1.4 McAb 的特性鉴定  41
  4.2 关于免疫胶体金诊断试纸条的组装  41-43
    4.2.1 胶体金的制备  41-42
    4.2.2 胶体金标记抗体最适pH 值  42
    4.2.3 McAb 与胶体金的结合比例  42
    4.2.4 NCM 的封闭  42-43
  4.3 关于免疫胶体金的诊断特点和改进方向  43-44
5 结论  44-45
致谢  45-46
参考文献  46-50
附录  50-54
攻读硕士学位期间发表的论文  54

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医临床医学 > 兽医诊断学 > 实验室诊断法
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