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1，3-丙二醇氧化还原酶和醛还原酶基因的克隆与表达

作　者: 张乐
导　师: 修志龙；王风刚
学　校: 大连理工大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: Klebsiella pneumoniae 1,3-丙二醇氧化还原酶 醛还原酶 NADPH NADH
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


1,3-丙二醇具有广泛的应用,特别是在聚酯合成工业上。微生物转化法生产1,3-丙二醇与化学法相比,具有明显的优点。近年来,微生物转化法越来越受到人们的重视。甘油歧化的氧化途径提供的NADH的量是有限的,从而限制了1,3-丙二醇的合成。代谢流分析表明,如果1,3-丙二醇氧化还原酶既能利用NADH,又能利用NADPH,将会增加1,3-丙二醇的产量。根据计算机模拟的结果,通过定点突变的方法将Asp41突变为甘氨酸,来改变该酶结合辅酶的特异性。酶活测定结果显示,突变酶分别以NADH和NADPH为辅酶时比酶活分别为629.38 U/mg和277.35 U/mg,而原始酶分别为706.90U/mg和20.95 U/mg。原始酶对NADH的米氏常数（Km）和转换数(kcat)分别为0.015mmol/L和90.64 1/s。突变酶对NADH的Km和kcat分别为0.48 mmol/L和411.61 1/s,对NADPH的Km和kcat分别为0.14 mmol/L和187.35 1/s。虽然突变酶利用两种辅酶的Km都有所增加,但是利用NADH的kcat比原始酶提高3.54倍,利用NADPH的kcat比原始酶提高1.07倍。以Klebsiella pneumoniae DSM2026基因组为模板,利用PCR技术扩增得到醛还原酶的基因yqhD,将其连接到表达载体pET23a（+）上,重组质粒在E.coli BL21（DE3）中得到了高效表达。经过Q-Sepharose和Sephacryl S-300两步柱层析纯化后,得到电泳条带单一的纯酶。以3-羟基丙醛为底物,测得该酶的比活力为3.8 U/mg,而以1,3-丙二醇为底物时,检测不到酶活力。该酶的最适pH为5.8,最适温度为60℃。该酶可利用多种底物,对丁醛的酶活力最高,其次是3-羟基丙醛。该酶对NADPH和NADH的Km值分别为0.07 mmol/L和1.42 mmol/L,表明它依赖辅酶的灵活性。在前期工作的基础上,构建了三个重组质粒pDK6-dhaT,pDK6-dhaT’和pDK6-yqhD,分别将三个重组质粒转化入Klebsiella pneumoniae DSM2026。在摇瓶培养实验中,甘油的初始浓度为50 g/L,构建的三株重组Klebsiella pneumoniae DSM2026（pDK6-OX）的1,3-丙二醇产量均比对照有了明显的提高。

全文目录


摘要  4-5
Abstract  5-10
引言  10-11
1 文献综述  11-24
  1.1 1,3-丙二醇的介绍  11-12
    1.1.1 1,3-丙二醇的性质与应用  11
    1.1.2 1,3-丙二醇的市场需求及生产状况  11-12
    1.1.3 1,3-丙二醇的生产方法  12
  1.2 微生物转化法生产1,3-丙二醇  12-14
    1.2.1 生产菌种  12-13
    1.2.2 甘油的代谢途径  13-14
  1.3 基因工程菌生产1,3-丙二醇的研究  14-19
    1.3.1 基因工程菌的构建策略  14-15
    1.3.2 通过基因敲除的方法构建合成1,3-丙二醇的基因工程菌  15-16
    1.3.3 在Saccharomyces cerevisiae中构建合成1,3-丙二醇的基因工程菌  16-17
    1.3.4 在Klebsiella pneumoniae中构建合成1,3-丙二醇的基因工程菌  17-18
    1.3.5 在E.coli中表达dha操纵子相关基因  18
    1.3.6 在E.coli中构建利用葡萄糖合成1,3-丙二醇的基因工程菌  18-19
  1.4 1,3-丙二醇生物合成途径中的关键酶  19-23
    1.4.1 甘油脱水酶  19-20
    1.4.2 1,3-丙二醇氧化还原酶  20-21
    1.4.3 醛还原酶  21-23
  1.5 本研究的目的及意义  23-24
2 1,3-丙二醇氧化还原酶的辅酶特异性改造  24-39
  2.1 引言  24
  2.2 实验材料和仪器  24-26
    2.2.1 菌株、质粒和试剂  24-25
    2.2.2 培养基  25
    2.2.3 仪器  25-26
  2.3 实验方法  26-31
    2.3.1 Klebsiella pneumoniae基因组DNA的提取  26-27
    2.3.2 1,3-丙二醇氧化还原酶基因dhaT的克隆  27-28
    2.3.3 1,3-丙二醇氧化还原酶基因dhaT的定点突变  28-29
    2.3.4 1,3-丙二醇氧化还原酶及其突变酶在大肠杆菌中的表达  29
    2.3.5 1,3-丙二醇氧化还原酶及其突变酶的酶活力测定  29-30
    2.3.6 1,3-丙二醇氧化还原酶及其突变酶的纯化  30-31
  2.4 实验结果与讨论  31-38
    2.4.1 1,3-丙二醇氧化还原酶基因dhaT的克隆  31-32
    2.4.2 1,3-丙二醇氧化还原酶基因dhaT的定点突变  32-33
    2.4.3 1,3-丙二醇氧化还原酶及其突变酶在大肠杆菌中的表达  33-34
    2.4.4 1,3-丙二醇氧化还原酶及其突变酶的纯化和酶活力测定  34-38
  2.5 小结  38-39
3 醛还原酶的克隆、表达与表征  39-53
  3.1 引言  39
  3.2 实验材料和仪器  39
    3.2.1 菌株、质粒和试剂  39
    3.2.2 培养基  39
    3.2.3 仪器  39
  3.3 实验方法  39-42
    3.3.1 醛还原酶基因yqhD的克隆  39-40
    3.3.2 序列测定  40
    3.3.3 醛还原酶在大肠杆菌中的表达  40-41
    3.3.4 醛还原酶的酶活力测定  41
    3.3.5 醛还原酶的纯化与表征  41-42
  3.4 实验结果与讨论  42-51
    3.4.1 醛还原酶基因yqhD的克隆  42-43
    3.4.2 重组质粒双酶切鉴定结果  43-44
    3.4.3 测序结果  44-45
    3.4.4 醛还原酶在大肠杆菌中的表达  45-46
    3.4.5 醛还原酶的纯化与表征  46-51
  3.5 小结  51-53
4 基因工程菌发酵甘油生产1,3-丙二醇的研究  53-69
  4.1 引言  53-54
  4.2 实验材料和仪器  54-55
    4.2.1 菌株、质粒和试剂  54
    4.2.2 培养基  54-55
    4.2.3 仪器  55
  4.3 实验方法  55-59
    4.3.1 重组质粒的构建与双酶切检验  55-57
    4.3.2 重组K.pneumoniae DSM2026(pDK6-OX)的构建及检验  57-58
    4.3.3 重组K.pneumoniae DSM2026(pDK6-OX)发酵甘油生产1,3-丙二醇  58-59
  4.4 实验结果与讨论  59-67
    4.4.1 重组质粒的构建与双酶切检验  59-61
    4.4.2 重组K.pneumoniae DSM2026(pDK6-OX)的构建及检验  61-62
    4.4.3 重组K.pneumoniae DSM2026(pDK6-OX)发酵甘油生产1,3-丙二醇  62-67
  4.5 小结  67-69
结论  69-70
参考文献  70-74
附录A 序列  74-75
附录B Marker  75-76
攻读硕士学位期间发表学术论文情况  76-77
致谢  77-78

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
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