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利用特异性S2-R2引物鉴定动物组织、人石蜡切片和临床皮损中的孢子丝菌

作　者: 王东
导　师: 刘晓明
学　校: 大连医科大学
专　业: 皮肤性病学
关键词: 孢子丝菌石蜡切片活组织标本 S2-R2引物小鼠
分类号: R450
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

申克氏孢子丝菌是孢子丝菌病的致病菌,主要引起皮肤,皮下组织和附近淋巴系统的亚急性和慢性感染,偶尔可以播散至骨骼和内脏,甚至诱发全身的播散性感染。本病在我国东北较为多发,可在流行区成批发生,危害人民健康。目前该病的诊断较为困难。真菌培养,不仅耗时(约一周),且阳性率不高;组织病理为非特异性肉芽肿性炎症,组织内病原学诊断仍只限于HE和PAS染色,但因菌量少,常规组织学方法很难发现。近年来,学者们在该病的诊断研究中进行了多方面的探索,包括血清学检测、免疫荧光抗体、免疫病理及电镜技术。血清学检测因特异性问题而未能延续;免疫荧光抗体与免疫病理技术的应用,虽然提高了诊断速度,却因抗体不易标准化、病理存在非特异染色等问题而限制其应用;电镜由于操作复杂,视野小很难发现病原菌而无法推广。我们课题组曾以50株不同地区来源的孢子丝菌临床分离株及标准株的基因组DNA作为研究样本,以毛霉、烟曲霉、念珠菌临床分离菌株基因组DNA作为对照,通过特异引物PCR扩增的方法筛选国内外文献中报道的4对孢子丝菌引物S2-R2、SSHF31-SSHR97、ITS3-SSP、SS3-SS4结果表明针对几丁质合成酶基因Ⅰ的引物S2-R2最特异且敏感。目的:本研究将以感染孢子丝菌的动物模型为研究样本,进一步对4对引物进行筛选,并将获得的特异而又敏感的引物用于石蜡切片及临床活检标本的孢子丝菌检测,以达到从基因水平对孢子丝菌病进行准确、快速诊断的目的,为尽早治疗提供依据,也可减少因误诊误治而造成的损失。材料和方法:(1)12只小鼠随机分成试验及对照组,实验组皮内注射孢子丝菌菌悬液,并于不同时间留取皮损组织,分别进行真菌培养和皮损组织DNA提取,PCR扩增。比较不同引物的敏感性和特异性。(2)取30例大连及10例长春地区临床疑诊孢子丝菌病、组织病理示感染性肉芽肿的石蜡切片标本,采用改良的微波脱蜡、液氮研磨-CTAB破壁法提取孢子丝菌DNA,以我们筛选获得的孢子丝菌特异而又敏感的S2-R2引物进行PCR扩增,扩增产物于1%琼脂糖凝胶中电泳,紫外灯下观察,与真菌培养的结果进行比对。(3)10例临床疑诊孢子丝菌病患者,在病理活检时获取0.4×0.8CM2皮损,平分皮损组织分别用于传统的真菌学鉴定(真菌培养,组织病理)及PCR检测。皮损经钝刀去除杂质后匀浆,离心取下层沉淀,以微量提取法(液氮研磨--CTAB法)提取其中的真菌DNA,以特异性S2-R2作为引物,进行PCR扩增,产物于1%琼脂糖凝胶中电泳,紫外灯下观察。结果:1.4对引物S2-R2,SSHF31-SSHR97,ITS3-SSP,SS3-SS4在感染孢子丝菌的小鼠皮损中均可扩增出目的条带,但引物SSHF31-SSHR97所需浓度较高,与在体外培养条件下筛试的结果相同,引物S2-R2为最敏感和特异的引物。2.30例初诊疑是孢子丝菌病的石蜡标本中PCR扩增阳性为22例,阳性率为73.33%。真菌培养阳性为22例。在22例真菌培养阳性的标本中有20例PCR出现阳性条带,阳性率为91%。8例真菌培养为阴性的标本中有2例PCR出现阳性条带,阳性率为25%。10例长春地区的标本中PCR阳性为7例,阳性率为70%。毛霉、烟曲霉、念珠菌病石蜡切片各1例的PCR扩增结果均阴性。3.10例临床疑似孢子丝菌病患者的组织标本分别取自躯干(5例),腕部(3例),面部(1例),眼睑(1例)。新鲜组织真菌培养9例阳性。菌落3-10天长出。10例标本提取基因组DNA,应用引物S2-R2进行PCR扩增所得结果9例阳性,与真菌培养的复合率为100%。结论:1.以感染孢子丝菌的小鼠模型为研究样本筛选孢子丝菌特异引物,结果与在体外菌纯培养菌株筛选所得结果相同,针对几丁质合成酶基因1的引物S2-R2为最特异、最敏感的引物。2.与传统方法相比,改良的微波脱蜡、液氮研磨-CTAB破壁法可以从存档的石蜡包埋组织中提取足量、高质量的孢子丝菌DNA。从而提高了PCR反应的阳性率。3.应用特异性S2-R2引物检测石蜡切片中的孢子丝菌阳性率可高达91%。对培养阴性的标本也能检出,阳性率为25%。该方法不仅可利用实验室保存的大量石蜡切片进行科研和临床回顾性诊断。同时也可作为疑难病的诊断和鉴别诊断依据。4.应用特异性S2-R2引物检测临床新鲜活检组织中的孢子丝菌,以真菌培养为参照,阳性率可达100%。该方法具有操作简单,经济省时,敏感特异性好,准确可靠等优点,适用于孢子丝菌病的快速诊断。

利用特异性S2-R2引物鉴定动物组织、人石蜡切片和临床皮损中的孢子丝菌

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