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抗虫基因cry2A~*对早粳稻的转化

作　者: 于滔
导　师: 李荣田
学　校: 黑龙江大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 粳稻 cry2A~* 转基因 PCR检测 外源基因表达
分类号: S511.22
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
下　载: 80次
引　用: 1次
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内容摘要


黑龙江省是我国最大的优质粳稻产区,在我国的农业生产中占有举足轻重的地位。自从1998年在黑龙江省哈尔滨地区的五常市稻田首次发现二化螟以来,螟虫有逐年加重危害和快速蔓延的势头,严重影响到水稻的产量。利用转基因技术培育抗虫水稻可以有效解决水稻虫害问题。本研究通过农杆菌介导的方法,利用可以进行转基因植物环境释放的bar基因作为选择标记,将经过密码子优化的、在单子叶ubi高效启动子调控下的、抗螟虫的Bt基因cry2A*转入具有代表性的黑龙江粳稻品种中,通过基因工程技术改良黑龙江粳稻对螟虫的抗性,创造适于寒区生态条件的抗虫转基因水稻材料,为黑龙江水稻实现少投入、多产出、保护生态环境的生产目标进行技术储备。本研究得到的主要结论如下:1、对目的基因cry2A*进行了酶切及PCR验证,结果表明用于转化的抗虫基因cry2A*准确无误,可以用于农杆菌介导的黑龙江水稻遗传转化工作。2、对农杆菌介导的、bar基因为筛选标记的北方粳稻遗传转化体系进行了优化。优化的遗传转化体系技术要点为成熟胚愈伤组织的诱导、愈伤组织继代1次、愈伤组织预培养、农杆菌侵染愈伤组织10min、共培养、使用具有一定渗透势的清菌液清菌、在含PPT 15mg/L的筛选培养基上筛选抗性愈伤组织、预分化、抗性愈伤组织在含CN 250mg/L的分化培养基上再生成苗、转化苗生根、炼苗和移栽到土壤等。3、利用优化的农杆菌介导外源基因转化北方粳稻体系对空育131、松粳9号和松粳6号等黑龙江水稻品种进行了遗传转化工作。经过密码子优化的、ubi调控下的cry2A*基因转化空育131,获得了324块独立抗性愈伤,移栽成活30个抗性愈伤,共171棵转化苗;转化松粳9号,获得了11块独立抗性愈伤及5棵转化苗;转化松粳6号,获得了4块独立抗性愈伤,14棵转化苗。4、对水稻转化株T0代进行目的基因cry2A*的PCR检测,检测结果显示空育131阳性率为98.2%,松粳9号和松粳6号PCR检测呈阳性率100%,cry2A*基因已经整合到黑龙江水稻品种空育131、松粳9号和松粳6号核基因组中。5、转cry2A*基因水稻空育131的T1代PPT抗性筛选结果显示,大部分转基因植株插入了1个单拷贝的外源基因,或是多拷贝基因中只有1个具有表达功能,或多拷贝整合在1个位点。对抗PPT的转基因空育131进行了RT-PCR检测,初步证实了目的基因cry2A*在转基因水稻中得到表达。

全文目录


中文摘要  2-4
Abstract  4-10
第1章 前言  10-20
  1.1 苏云金芽孢杆菌及其杀虫晶体蛋白  10-12
    1.1.1 苏云金芽孢杆菌简介  10
    1.1.2 Bt 杀虫晶体蛋白及其基因的分类  10-11
    1.1.3 Bt 杀虫晶体蛋白杀虫机理  11
    1.1.4 转Bt 基因水稻研究概况  11-12
  1.2 植物基因工程常用启动子  12-16
    1.2.1 组成型启动子  13-14
    1.2.2 组织特异性启动子  14-15
    1.2.3 诱导型启动子  15-16
  1.3 水稻转化常用筛选标记基因  16-17
    1.3.1 nptⅡ  16
    1.3.2 hpt  16
    1.3.3 bar  16-17
  1.4 密码子偏爱性及 Bt 基因密码子优化  17-18
    1.4.1 密码子偏爱性  17-18
    1.4.2 Bt 基因密码子优化  18
  1.5 本研究的目的及意义  18-20
第2章 材料与方法  20-35
  2.1 植物材料  20
  2.2 细菌菌株  20
  2.3 基因、质粒和植物表达载体  20-22
  2.4 试剂盒、主要试剂和仪器设备  22-23
    2.4.1 试剂盒  22
    2.4.2 主要试剂  22
    2.4.3 主要仪器设备  22-23
  2.5 培养基  23-25
    2.5.1 细菌培养基  23
    2.5.2 水稻遗传转化培养基  23-25
  2.6 目的基因的验证  25-28
    2.6.1 质粒DNA 的小量提取（碱裂解法）  25
    2.6.2 大肠杆菌感受态细胞的制备与转化(电击法)  25-26
    2.6.3 重组质粒酶切鉴定  26-27
    2.6.4 重组质粒 PCR 验证  27-28
  2.7 根瘤农杆菌介导的水稻遗传转化体系及其优化  28-31
    2.7.1 愈伤组织的诱导  28
    2.7.2 愈伤组织的继代  28
    2.7.3 愈伤组织的预培养  28
    2.7.4 根瘤农杆菌的培养及处理  28
    2.7.5 根瘤农杆菌侵染转化水稻愈伤组织及共培养  28-29
    2.7.6 清菌和筛选  29
    2.7.7 抗性愈伤的预分化与转基因植株的再生  29
    2.7.8 遗传转化体系的优化  29-31
  2.8 转化水稻的分子检测  31-35
    2.8.1 T_0 代目的基因整合检测  31-32
    2.8.2 T_1 代外源基因表达检测  32-35
第3章 结果与分析  35-47
  3.1 目的基因的验证  35-36
    3.1.1 酶切鉴定  35-36
    3.1.2 PCR 验证  36
  3.2 根瘤农杆菌介导的水稻遗传转化体系优化  36-40
    3.2.1 不同基因型愈伤组织诱导率  36-37
    3.2.2 愈伤组织继代次数对抗性愈伤的影响  37-38
    3.2.3 侵染时间的确定  38-39
    3.2.4 清菌方法及筛选培养基抑菌性抗生素浓度  39
    3.2.5 PPT 有效筛选浓度  39-40
    3.2.6 分化培养基抑菌抗生素浓度  40
  3.3 转基因水稻植株的获得  40-41
  3.4 转基因植株T_0 代PCR 检测  41-42
  3.5 转基因植株T_1 代株系外源基因表达  42-47
    3.5.1 bar 基因表达  42-45
    3.5.2 cry2A~*基因表达的RT-PCR 检测  45-47
第4章 讨论  47-54
  4.1 农杆菌介导获得转cry2A~*基因粳稻的意义  47
  4.2 农杆菌介导粳稻遗传转化体系的改进  47-50
  4.3 提高外源基因表达的途径  50-51
  4.4 筛选标记基因  51-52
  4.5 T_1 代遗传规律分析  52-54
结论  54-55
参考文献  55-62
附录  62-67
致谢  67-68

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中图分类: > 农业科学 > 农作物 > 禾谷类作物 > 稻 > 按米的粘性分 > 粳稻
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