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叠加突变改善扩展青霉脂肪酶的热稳定性

作　者: 蔡少丽
导　师: 林琳
学　校: 福建师范大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 扩展青霉碱性脂肪酶 叠加突变 热稳定性
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
下　载: 62次
引　用: 3次
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内容摘要


本研究利用单点突变和叠加突变技术手段，对扩展青霉脂肪酶(Penicillium expansum lipase，PEL)进行热稳定性的蛋白质工程改造。ep8是由本课题组获得的含有一个突变点的随机突变热稳定性脂肪酶，在利用PCR介导的分子克隆技术构建pSK-ep8模板后，采用重叠延伸PCR的方法构建了PEL-ep8-K115R、PEL-ep8-K55R、PEL-ep8-E214P、PEL-ep8-S104V、PEL-ep8-S139V、PEL-ep8-N166E、PEL-ep8-G205P、PEL-ep8-A170P、PEL-ep8-A144P、PEL-ep8-A105P等10个叠加突变体，将上述突变基因在毕赤酵母GS115中表达，获得了10种含有突变基因的产脂肪酶工程菌。发酵获得突变酶并进行了其稳定性的研究。本研究共获得了3株热稳定性有所改善的叠加突变脂肪酶，一株为最适作用温度下降5℃，同时热稳定性Tm值分别比野生型和随机突变酶提高3.5℃和2.0℃的热稳定性低温酶PEL-ep8-K115R-GS，其发酵酶活为696U／mL，表达量为480ug／mL，比活为1449.0U／mg。一株为Tm值分别比野生型和随机突变酶提高4.5℃和3.2℃的热稳定性酶PEL-ep8-E214P-GS，其发酵酶活为645U／mL，表达量为220ug／mL，比活为2931.8U／mg。一株为热稳定性Tm值比野生型酶提高2.3℃，且与随机突变酶相仿的热稳定性酶PEL-ep8-K55R-GS，发酵酶活为508U／mL，表达量为220ug／mL，比活为2309.1U／mg。本研究还获得了7个叠加突变脂肪酶，它们的热稳定性没有明显的改善，有的甚至由于突变对空间构象的巨大影响而使突变酶失去了绝大部分活性。叠加突变酶PEL-ep8-N166E-GS，其Tm值为37.9℃，与野生型的相仿；叠加突变酶PEL-ep8-S104V-GS，其Tm值为39.1℃，比野生型下降1.6℃；叠加突变酶PEL-ep8-S139V-GS，其Tm值为35.7℃，比野生型下降5.4℃。还有叠加突变酶PEL-ep8-G20SP-GS、PEL-ep8-A170P-GS、PEL-ep8-A144P-GS、PEL-ep8-A105P-GS，它们在经过YPOM板筛选后，都没有产生很明显的透明圈，说明这四个叠加突变酶通过突变后已经丧失了绝大部分甚至全部的活性。

全文目录


摘要  2-3
Abstract  3-5
中文文摘  5-8
目录  8-11
第1章 绪论  11-29
  1.1 课题背景  11-12
  1.2 酶热稳定性概述  12-29
    1.2.1 简介  12-13
    1.2.2 酶热稳定性的定义  13
    1.2.3 热稳定性酶的特性  13-14
    1.2.4 热稳定性酶的优点及应用  14-15
    1.2.5 酶的热失活机制  15-16
    1.2.6 影响酶热稳定性的因素  16-22
    1.2.6 提高酶热稳定性策略  22-29
第2章 材料与方法  29-45
  2.1 材料  29-32
    2.1.1 菌种和载体  29
    2.1.2 工具酶  29
    2.1.3 其它试剂  29
    2.1.4 常用培养基和缓冲液  29-30
    2.1.5 寡聚核苷酸引物  30-32
    2.1.6 常用仪器  32
  2.2 实验方法  32-45
    2.2.1 pSK-ep8模板的构建  32-35
      2.2.1.1 ep8基因组的制备  32
      2.2.1.2 目的基因的获得  32-33
      2.2.1.3 克隆载体pSK-ep8的构建  33-34
      2.2.1.4 载体pSK-ep8的转化与筛选  34
      2.2.1.5 重组质粒DNA的制备  34-35
      2.2.1.6 pSK-ep8重组质粒(模板)的测序  35
    2.2.2 叠加及单点突变  35-45
      2.2.2.1 PEL-ep8-K115R叠加突变(重叠延伸PCR)  35-38
      2.2.2.2 PEL-K115R单点突变  38-39
      2.2.2.3 PEL-ep8-K55R叠加突变  39-40
      2.2.2.4 PEL-ep8-E214P叠加突变  40
      2.2.2.5 PEL-E214P单点突变  40-41
      2.2.2.6 PEL-ep8-S104V叠加突变  41
      2.2.2.7 PEL-ep8-S139V叠加突变  41
      2.2.2.8 PEL-ep8-N166E叠加突变  41-42
      2.2.2.9 PEL-ep8-G205P叠加突变  42
      2.2.2.10 PEL-ep8-A170P叠加突变  42
      2.2.2.11 PEL-ep8-A144P叠加突变  42-43
      2.2.2.12 PEL-ep8-A105P叠加突变  43-45
第3章 结果与分析  45-73
  3.1 pSK-ep8模板的构建  45
  3.2 叠加及单点突变  45-73
    3.2.1 突变点的选择  45-46
    3.2.2 PEL-ep8-K115R叠加突变  46-51
      3.2.2.1 突变基因的获得  46-47
      3.2.2.2 重组表达质粒pAO815-ep8-K115R的构建及筛选  47-48
      3.2.2.3 突变基因在毕赤酵母GS115中的表达  48-49
      3.2.2.4 PEL-ep8-K115R-GS最适作用温度和热稳定性的研究  49-51
    3.2.3 PEL-K115R单点突变  51-54
      3.2.3.1 突变基因的获得  51
      3.2.3.2 突变基因在毕赤酵母GS115中的表达  51-52
      3.2.3.3 PEL-K115R-GS的最适作用温度和热稳定性  52-54
    3.2.4 PEL-ep8-K55R叠加突变  54-57
      3.2.4.1 突变基因的获得  54
      3.2.4.2 突变基因在毕赤酵母GS115中的表达  54-55
      3.2.4.3 PEL-ep8-K55R-GS最适作用温度和热稳定性研究  55-57
    3.2.5 PEL-ep8-E214P叠加突变及PEL-E214P单点突变  57-60
      3.2.5.1 突变基因的获得  57
      3.2.5.2 突变基因在毕赤酵母GS115中的表达  57-58
      3.2.5.3 PEL-ep8-E214P-GS及PEL-ep8-GS的最适作用温度和热稳定性  58-60
    3.2.6 PEL-ep8-S104V叠加突变  60-63
      3.2.6.1 突变基因的获得  60
      3.2.6.2 突变基因在毕赤酵母GS115中的表达  60-61
      3.2.6.3 PEL-ep8-S104V-GS最适作用温度与热稳定性研究  61-63
    3.2.7 PEL-ep8-S139V-GS叠加突变  63-65
      3.2.7.1 突变基因的获得  63
      3.2.7.2 突变基因在毕赤酵母GS115中的表达  63-64
      3.2.7.3 PEL-ep8-S139V-GS最适作用温度和热稳定性研究  64-65
    3.2.8 PEL-ep8-N166E-GS叠加突变  65-68
      3.2.8.1 突变基因的获得  65-66
      3.2.8.2 突变基因在毕赤酵母GS115中的表达  66
      3.2.8.3 PEL-ep8-N166E-GS的最适作用温度和热稳定性  66-68
    3.2.9 PEL-ep8-G205P-GS叠加突变  68
      3.2.9.1 突变基因的获得  68
      3.2.9.2 突变基因在毕赤酵母GS115中的表达  68
    3.2.10 PEL-ep8-A170P-GS叠加突变  68-69
      3.2.10.1 突变基因的获得  68-69
      3.2.10.2 突变基因在毕赤酵母GS115中的表达  69
    3.2.11 PEL-ep8-A144P-GS叠加突变  69-70
      3.2.11.1 突变基因的获得  69-70
      3.2.11.2 突变基因在毕赤酵母GS115中的表达  70
    3.2.12 PEL-ep8-A105P-GS叠加突变  70-73
      3.2.12.1 突变基因的获得  70-71
      3.2.12.2 突变基因在毕赤酵母GS115中的表达  71-73
第4章 讨论  73-77
结论  77-79
附录 英文缩略词表  79-81
参考文献  81-89
攻读学位期间承担的科研任务与主要成果  89-91
致谢  91-93
个人简历  93-95

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
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