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鱼类卵黄蛋白原调理作用的研究

作　者: 刘敏
导　师: 张士璀
学　校: 中国海洋大学
专　业: 海洋生物学
关键词: 鲈鱼卵黄蛋白原巨噬细胞 FcγRs Ⅰ型调理
分类号: Q51
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 74次
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内容摘要

硬骨鱼类虽然具有和高等脊椎动物相似的免疫系统,但作为低等脊椎动物,其特异性免疫机制尚不完善,非特异性免疫占据更为重要的地位。在非特异性免疫中,吞噬细胞在鱼类抗感染免疫中发挥核心作用。一些能与抗原结合并促进吞噬细胞吞噬功能的物质称为调理素；通过结合调理素辅助吞噬作用的现象称为调理化。目前,已经发现的调理素主要有补体活化成分C3b及IgG类抗体。新近,Li等人(2008；2009)的研究表明鱼类卵黄蛋白原(Vitellogenin, Vg)也能发挥调理素的功能。然而,关于Vg参与调理作用的机理完全不了解。本论文主要目的就是研究Vg的调理作用类型与机理。本论文首先利用Percoll密度梯度离心法从鲈鱼(Lateolabrax japonicus)头肾中分离纯化得到了巨噬细胞,并对其噬菌功能进行了鉴定。通过吞噬实验统计两个参数——吞噬能力(PA)和吞噬指数(PI)来评价巨噬细胞的噬菌水平,发现鲈鱼头肾巨噬细胞和酵母作用90min时吞噬能力可能达到最大值。然后,用鲈鱼头肾巨噬细胞吞噬与六线鱼(Hexagrammos otakii) Vg孵育过的酵母,结果发现,与对照相比,经Vg处理的实验组的PA和PI都有显著性提高(p<0.05),说明Vg的调理素功能不具有种属特异性。利用六线鱼Vg可以促进鲈鱼头肾巨噬细胞吞噬作用这一系统,接着我们证明了Vg调理功能可被lavendustin(蛋白酪氨酸激酶PTK的特异性抑制剂)、PP1(蛋白酪氨酸激酶PTK的特异性抑制剂)和staurosporine(蛋白激酶C PKC抑制剂)所影响；但不受nocodazole(微管抑制剂)和C3 exoenzyme (Rho GTPases抑制剂)的影响,说明Vg的调理功能可能属于Ⅰ型机制。由于巨噬细胞Ⅰ型调理是由巨噬细胞膜表面受体FcyRs介导,激发吞噬信号传导通路。接下来,我们进一步验证FcyRs是否参与了Vg的调理。我们用异硫氰酸荧光素(FITC)标记的FcγRs三类受体的单克隆抗体FcγRⅠ、FcγRⅡ和FcγRⅢ与鲈鱼巨噬细胞孵育,荧光显微镜观察发现这三种单克隆抗体均可以与巨噬细胞结合,表明巨噬细胞表面存在FcγRⅠ、FcγRⅡ和FcγRⅢ这三种受体。在此基础上,我们进而用这三种单抗对巨噬细胞表面相应受体进行封闭,检测受体封闭对Vg的调理功能的影响,结果发现,与对照相比,受体封闭能不同程度地抑制巨噬细胞吞噬Vg孵育过的酵母,说明Vg可能通过与FcγRⅠ、FcγRⅡ和FcγRⅢ这三种受体结合介导调理过程。我们还对蛋白质酪氨酸激酶Sky和PI3-激酶是否参与Vg调理过程进行了研究。用蛋白质酪氨酸激酶Sky和PI3-激酶各自的特异性抑制剂piceatannol和wortmannin对鲈鱼巨噬细胞进行处理,通过realtime PCR的方法检测Vg调理后炎症因子TNF-α和IL-1β基因表达量的变化情况,结果发现,与对照相比,抑制剂处理组的TNF-α和IL-1β表达量有显著性下降(p<0.05),说明蛋白质酪氨酸激酶Sky和PI3-激酶可能参与Vg调理过程的信号传导,影响炎症因子的产生。总之,本文首次证明了鱼类Vg诱导的吞噬作用属于Ⅰ型调理吞噬作用。经典的Ⅰ型调理吞噬作用主要由IgG抗体诱导,后来发现CRP诱导的吞噬作用也属于Ⅰ型调理吞噬作用。这说明Vg和CRP一样在诱导吞噬方面具有类抗体功能。

全文目录

摘要  5-7
Abstract  7-13
第一章文献综述  13-27
  1 前言  13-17
    1.1 鱼类吞噬细胞简介  13-14
    1.2 吞噬细胞杀菌机理  14-17
  2 吞噬调理作用研究进展  17-24
    2.1 吞噬调理的发现  17
    2.2 两种类型调理作用  17-24
  3. 研究内容和技术路线  24-27
第二章鲈鱼(Lateolabrax japonicus)巨噬细胞的分离及其吞噬动力学  27-37
  1 前言  27
  2 材料与方法  27-32
    2.1 试验材料  27-28
    2.2 酵母的培养  28
    2.3 FITC标记酵母  28-29
    2.4 巨噬细胞的分离  29-31
    2.5 巨噬细胞噬菌鉴定和吞噬动力学  31-32
  3 结果  32-35
    3.1 鲈鱼头肾巨噬细胞的分离  32-33
    3.2 巨噬细胞吞噬动力学  33-35
  4 讨论  35-37
第三章卵黄蛋白原的调理作用  37-68
  1 前言  37-38
  2 材料与方法  38-50
    2.1 试验材料  38-39
    2.2 酵母的培养、FITC标记酵母和巨噬细胞的分离同第二章  39
    2.3 六线鱼卵黄蛋白原对鲈鱼巨噬细胞的吞噬调理  39-40
    2.4 lavendustin抑制巨噬细胞PTK实验  40-41
    2.5 PP1抑制巨噬细胞PTK实验  41
    2.6 staurosporine抑制巨噬细胞PKC实验  41-42
    2.7 nocodazole抑制巨噬细胞microtubules实验  42-43
    2.8 C3 exoenzyme抑制巨噬细胞Rho实验  43
    2.9 鲈鱼巨噬细胞上受体FcγRs的鉴定  43-44
    2.10 受体FcγRs的单克隆抗体对卵黄蛋白原调理功能的影响  44-46
    2.11 两种抑制剂对卵黄蛋白原调理作用的影响  46-50
  3 结果  50-65
    3.1 六线鱼卵黄蛋白原对鲈鱼巨噬细胞的调理  50-51
    3.2 lavendustin抑制巨噬细胞PTK实验  51-53
    3.3 PP1抑制巨噬细胞PTK实验  53-55
    3.4 staurosporine抑制巨噬细胞PKC实验  55-57
    3.5 不同浓度nocodazole抑制巨噬细胞microtubules实验  57-58
    3.6 不同浓度C3 exoenzyme抑制巨噬细胞Rho实验  58-59
    3.7 巨噬细胞上受体FcγRs的鉴定  59-60
    3.8 受体FcγR的单克隆抗体对卵黄蛋白原调理功能的影响  60-62
    3.9 两种抑制剂对卵黄蛋白原调理作用的影响  62-65
  4 讨论  65-68
结论  68-69
参考文献  69-79
致谢  79-81
作者简介  81-82
发表的学术论文  82-83
缩略语  83

鱼类卵黄蛋白原调理作用的研究

内容摘要

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