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运动性疲劳所致学习记忆能力改变的证候特点及基于PKA-CREB信号通路的机制研究

作　者: 于爽
导　师: 李峰
学　校: 北京中医药大学
专　业: 中医诊断学
关键词: 生物学机制学习记忆运动性疲劳中医证候 PKA-CREB信号转导通路
分类号: R87
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

运动性疲劳是日常生活和体育运动中的常见现象,而学习记忆能力又是我们从事日常工作生活乃至体育竞技的重要基础。既往的临床和实验研究中都证实,运动性疲劳对人体及实验动物的学习记忆能力都有着一定影响,其机理目前尚属于研究阶段,有待于进一步的完善及系统化,因此不能很好地指导预防和干预。由此可见,深入研究运动性疲劳影响学习记忆的机理有着十分重要的意义。本文通过理论研究与实验研究两部分对运动性疲劳导致学习记忆的改变的中医证候及相关神经生物学机制进行了探讨。既往研究表明,PKA-CREB信号通路与学习记忆能力密切相关。而由运动性疲劳所导致的学习记忆能力的改变是否与该信号转导通路有关尚不明确。因此,本研究结果将明确PKA-CREB信号通路的作用,为进一步阐述运动性疲劳导致学习记忆能力改变的分子生物学机制提供理论依据。本研究结合动物实验,利用相关中药方剂的干预治疗,探讨中医肝脏、脾脏、肾脏对运动性疲劳所致学习记忆改变的影响,为病证结合研究奠定基础,从而明确运动性疲劳导致学习记忆改变的相关中医学证候。应用免疫组化方法测定大鼠海马细胞中的PKA及CREBl蛋白表达的变化,来研究PKA-CREB信号通路在运动性疲劳所致学习记忆改变过程中所起的作用。1理论研究本部分主要从中医学的角度对运动性疲劳所致学习记忆改变的机制进行探讨。祖国医学有着自己独特的辨证论治体系,强调外与内的必然联系。中医病机学是以五脏为中心的藏象理论。合理的运用脏腑、气血、经络等相关的中医理论可以很好地认识疾病的产生机制,探讨其病理过程的本质,并对临床治疗有着重要的指导意义。中医认为运动性疲劳的发病机制主要与内在脏腑的功能失调有关,并且认为学习和记忆是一种精神活动,可归之为“神志”的范畴。“神志”是生命活动中重要的部分,而“五脏藏神”理论又是中医学认识神志类疾病的基本方法之一。运动性疲劳导致学习记忆能力的改变从中医学的角度考虑,强调了形神一体。“神志”是由五脏精气所化生,通过调理脏腑精气的功能可以改善“神志”的状态。也就是说,我们可以通过辨证论治,改善机体脏腑功能,从而改善运动性疲劳所致的学习记忆能力的改变,为临床治疗提供理论基础。1.1中医对运动性疲劳的认识中医对“劳”的认识是指较长时期的过度用力而积劳成疾。从临床表现来看,可属于“劳倦”范畴,包括体劳、心劳和房劳。而运动性疲劳主要是指体劳和心劳。当人体做大量运动后,肌肉和躯体出现疲劳,运动能力下降,同时可伴有思想、精神处于高度紧张的应激状态,导致学习和记忆能力的下降。中医学认为,疲劳时人体的脏腑、气血平衡失调,精、气、神受损。中医学的理论核心是整体观念和辨证施治,运动性疲劳是一个复杂的过程,可以看作是整体功能失调的反映,与中医五脏的关系十分密切。我们在辨证的时候可以将其分为两个阶段：第一阶段为肝气失调；第二阶段可根据定位分为形体疲劳(以筋、脉、骨、肌、关节疲劳为主),脏腑疲劳(主要是肝、心、脾、肺、肾的功能失调或下降),神志疲劳(主要是情绪变化和运动性紧张、失虑等)。也可根据定性的不同将其分为肝气郁结型、肝脾不调型、气阴不足型和湿热内生型。通过以上分型再结合中医药疗法的优势,才能达到消除疲劳,恢复体力的目的。1.2中医对学习和记忆的认识学习和记忆能力是大脑的高级活动,从中医学的角度,可将其归之为“神”或“神志”的范畴。《灵枢·天年》曰：“血气已和,荣卫已通,五藏已成,神气舍心,魂魄毕具,乃成为人。”又说：“百岁,五藏皆虚,神气皆去,形骸独居而终矣。”由此可见,神具有控制、调节机体生理功能的作用。脏腑功能的正常与否有赖于神的调节。“神”又分为广义之神与狭义之神。广义之神是指一切生命活动的内在变化和总规律,即人的生命力；而狭义之神就是指神志,包括人体的感觉、意识、情绪、思维等心理活动过程。运动性疲劳可以归为广义之神,而学习和记忆的过程应属于狭义之神的范畴。临床上,可以通过人体的语言、呼吸、饮食、排泄、以及生命活动的表现来判断神的情况。1.3从“形神统一”的角度认识运动性疲劳与学习记忆的关系中医学认为“心藏神、肺藏魄、肝藏魂、脾藏意、肾藏志”,充分说明了五脏与五志的关系。现代研究将运动性疲劳分为生理疲劳和心理疲劳,其中生理疲劳包括了中枢疲劳和外周疲劳,与中医广义之神相关；而心理疲劳可导致情志的改变,影响学习和记忆能力,与中医狭义之神相关。因此,可以利用五脏藏神的理论来解释运动性疲劳导致学习记忆改变的病机,并且可以通过“从脏论治”,来调理脏腑功能,从而改善学习记忆能力。2实验研究2.1运动性疲劳大鼠动物模型的建立在本次研究过程中,我们选择了SD大鼠,通过10天的游泳训练,建立起运动性疲劳的动物模型。此模型是一种比较理想的运动性疲劳的动物模型,可以使大鼠在较短的周期内运动强度维持在较高的水平,从而避免了额外应激因素而引起实验误差,目前已被广泛采用。在造模过程中,对动物的体重、进食量及精神状态等一般情况进行观察。我们发现模型组及训练加中药各组大鼠与空白对照组相比,进食量减少、体重增长缓慢甚至到训练结束后出现了体重下降的情况,直观的反应了模型动物出现了不同程度的疲劳。在造模结束后取材,测量各组大鼠血清CK及BUN的变化,结果证实,本次研究的运动性疲劳大鼠模型的复制是成功的。为了从中医的角度研究运动性疲劳过程中的相关中医证候,我们采用“以方测证”的方法,分别给予模型动物以具有疏肝理气作用的中药方剂四逆散、具有益气健脾作用的四君子汤和具有补肾作用的金匮肾气丸。通过中药的干预治疗,观察各组动物的一般状况及血清学指标的不同,从而确定运动性疲劳的相关中医证候。我们的实验结果表明,给予以上疏肝、健脾、补肾的中药方剂后,可以从不同程度上改善运动性疲劳的状况。因此我们认为,运动性疲劳的发生可能与中医认为的肝、脾、肾的功能失调有关。2.2运动性疲劳大鼠学习记忆能力的评价大鼠进行游泳训练后出现了不同程度的运动性疲劳,而这种疲劳是否出现了学习记忆能力的改变还有待于进一步的研究。既往理论研究表明,运动性疲劳可能导致学习记忆能力的改变,这种改变可能与生理疲劳或心理疲劳有关。我们通过测定水迷宫实验和被动回避反应来观测其记忆能力的变化。通过给予模型动物中药的干预治疗,研究学习记忆能力的相关中医证候。水迷宫实验结果显示,模型组与正常对照组相比学习和记忆的游出时间显著延长(P<0.01),出错次数显著增多(P<0.01)；而被动回避实验结果显示,模型组与正常对照组相比较避暗潜伏期明显缩短(P<0.01),避暗错误次数显著增多(P<0.01)。以上结果说明运动性疲劳可导致大鼠学习记忆能力的降低。水迷宫实验中,疏肝中药组、健脾中药组、补肾中药组实验动物与模型组相比较,学习和记忆的游出时间有所降低,出错次数减少；在被动回避实验中,各中药组实验动物相比于模型组,避暗潜伏期在一定程度上有所提高,避暗实验错误次数也有所减少。实验结果显示,疏肝中药组实验动物的学习记忆能力提高最为明显。因此,我们可以推断,运动性疲劳导致学习记忆能力的改变在中医方面,可能与肝脏的功能失调密切相关。2.3运用免疫组化的方法测定模型动物海马细胞中PKA, CREB1含量的变化既往研究表明,蛋白激酶A-cAMP反应元件结合蛋白(protein kinase A-cAMP response element binding protein, PKA-CREB)信号转导通路在中枢神经系统中起着关键的作用,能促进神经细胞的存活、再生、分化等,与学习记忆能力密切相关。CREB被称为记忆的“开关”,在海马脑片长时程增强(LTP)中起着重要的作用。长时程记忆的产生与保持需要合成新的蛋白质,而蛋白质合成的第一步是基因转录成mRNA。CREB作为一个核内的转录因子,调控着基因的表达。CREB是结合在DNA的特殊部位,即cAMP反应单元(cAMP response element, CRE)的一种蛋白质。当CREB与CRE结合之后,可大大提高CRE下游基因的转录活性。CREB调节转录功能,又受到本身磷酸化作用的调节。目前已知,CREB分子是多种蛋白激酶的磷酸化底物。在这些激酶中,最早被确认的一种是蛋白激酶A(protein kinase A, PKA). PKA存在于细胞质中,由两个催化亚基(C亚基)和两个调节亚基(R亚基)组成,对神经元的存活与生长,以及突触的可塑性和长期记忆的形成中起着重要的正调节作用。因此本次实验运用免疫组化的方法测定模型动物海马CA1区PKA. CREB1含量的变化,结果用阳性反应物的平均光密度(MOD)表示,从而确定该通路是否参与了运动性疲劳导致学习记忆的改变,并探讨与其相关的中医证候。实验结果表明,模型组的PKA及CREB1阳性反应物在大鼠海马的表达较空白对照组均有明显降低,而训练加中药各组与模型组相比有不同程度的提高,以疏肝组提高较明显。我们通过理论研究和实验研究得出以下结论：1通过动物实验表明运动性疲劳可以导致机体学习记忆能力的下降；2 PKA-CREB信号转导通路参与了运动性疲劳导致学习记忆改变的调控,并且对学习记忆的形成有正向调控的作用；3通过给予具有疏肝、健脾、补肾作用的中药方剂(四逆散、四君子汤和金匮肾气丸)对动物模型进行干预后,实验结果表明运动性疲劳导致的学习记忆能力下降与中医学的肝脏、脾脏、肾脏的功能失调有关,而与肝脏的关系更为密切。

全文目录

中文摘要  4-8
Abstract  8-14
英文缩略语表  14-15
文献综述  15-28
  综述一运动性疲劳与学习记忆关系的研究进展  15-22
    参考文献  20-22
  综述二 PKA-CREB信号通路的研究进展  22-28
    参考文献  25-28
前言  28-29
第一部分理论研究从中医学角度探讨运动性疲劳导致学习记忆改变的机理  29-35
  1 中医对运动性疲劳的认识  29-31
  2 中医对学习和记忆的认识  31-32
  3 从‘形神统一”的角度认识运动性疲劳与学习记忆的关系  32-34
  参考文献  34-35
第二部分实验研究  35-58
  实验研究一运动性疲劳大鼠动物模型的建立  36-43
    1 实验动物及分组  36
    2 运动性疲劳大鼠模型的建立  36-37
    3 指标检测及方法  37
    4 实验结果  37-39
    5 讨论  39-43
  实验研究二运动性疲劳大鼠学习记忆能力的评定  43-49
    1 实验动物及分组  43
    2 相关行为学实验的测定方法  43-44
      2.1 水迷宫实验  43-44
      2.2 被动回避反应  44
    3 数据处理  44
    4 实验结果  44-46
    5 讨论  46-49
  实验研究三运用免疫组化法测定模型动物海马细胞中PKA、CREB1含量的变化  49-58
    1 实验动物及分组  49
    2 实验仪器及试剂  49-51
    3 标本的采集与制备  51-52
    4 结果处理  52
    5 实验结果  52-55
    6 讨论  55-58
参考文献  58-59
结论  59-61
致谢  61-62
个人简历  62-63
附图  63-65

运动性疲劳所致学习记忆能力改变的证候特点及基于PKA-CREB信号通路的机制研究

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