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母婴分离大鼠恐惧记忆易感性差异表达基因的筛选

作　者: 孙秀敏
导　师: 赵虎
学　校: 汕头大学
专　业: 法医学
关键词: 母婴分离场景性恐惧记忆空间学习记忆抑制消减杂交
分类号: R749.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

目的创伤后应激障碍( Posttraumatic Stress Disorder,PTSD)存在较多的易感因素,包括性别、年龄、种族、遗传因素、父母PTSD病史及早期的不良经历等,生命早期不良应激作为重要的易感因素之一,逐渐引起大家的关注。研究生命早期不良应激这一环境因素导致基因表达的改变,为危险儿童人群的预防及PTSD的治疗寻找有效的药物作用及心理干预靶点,具有重要的意义。因此,本课题采用母婴分离动物模型及场景恐惧记忆动物模型和抑制消减杂交的方法,研究生命早期不良应激致成年后恐惧记忆易感性改变的相关差异表达基因,并分析差异表达基因在易感性机制中的可能作用,探索母婴分离对成年后恐惧记忆的形成和保持的易感性的影响。方法第一部分:1、母婴分离动物模型:幼鼠出生后第1-21天,将所有幼鼠拎出放入另一笼中,6h后将新生幼鼠送回笼中与母鼠团聚,出生后第21天每笼6只饲养。正常对照组大鼠出生后按正常饲养,不与母鼠分离。21天后断奶,每笼6只饲养。2、场景恐惧记忆动物模型:训练:将大鼠轻轻放到大鼠测试笼中,让其自由活动180秒,然后给予大鼠足部电击2秒(非条件刺激,US),0.8mA,共三次,每次间隔60秒。训练结束后,大鼠在训练箱中继续停留60秒,然后将其送回饲养笼。训练结束后1小时和24小时,分别进行场景恐惧记忆保持能力的检测。3、空间学习记忆检测:前4天为训练阶段,每天训练4次,把大鼠面向池壁随机从任一象限放入池中,并记录大鼠寻找暗藏的平台时间(逃避潜伏期)以及上站台前路程,找到平台后允许动物在平台上停留30s;如果大鼠在90s内未找到平台,记为90s。每日4次成绩的平均值为当日成绩。第5天,辙除站台,记录大鼠在90s内的游泳轨迹,分别计算其跨越目标象限内的游泳时间和路程占整个游泳时间的百分率。第二部分:应用抑制消减杂交技术(Suppression subtractive hybridization, SSH)筛选母婴分离组和正常组成年大鼠场景性恐惧记忆之后差异表达基因,将获得的序列进行同源性比较。结果行为学结果:雌性大鼠在电击之前母婴分离组场景恐惧记忆的获得强于正常组,电击之后,母婴分离组场景恐惧记忆的获得弱于正常组。而雄性大鼠在电击之前和电击之后场景性恐惧记忆的获得的差异均无统计学意义。场景恐惧记忆的保持,1h后短时记忆的检测,雌性大鼠母婴分离组僵直时间明显低于正常组(P<0.01);雄性大鼠母婴分离组僵直时间与正常组相比差异无统计学意义(P=0.673)。同时母婴分离对成年后场景恐惧记忆的保持存在性别差异,母婴分离组雌性大鼠僵直时间明显低于雄性大鼠(P<0.01)24h长时记忆检测,在恐惧记忆训练后,雌性大鼠母婴分离组僵直时间明显低于正常组(P<0.01);雄性大鼠母婴分离组僵直时间与正常组相比差异无统计学意义(P=0.093)。同时母婴分离对成年后场景性恐惧记忆的保持存在性别差异,母婴分离组雌性大鼠僵直时间明显低于雄性大鼠(P<0.01)空间学习记忆检测结果:雌性和雄性大鼠母婴分离组潜伏期、上台前路程与对应的对照组相比差异无统计学意义;在空间探索实验中,雌、雄性大鼠母婴分离组目标象限停留时间的百分比、目标象限停留距离的百分比均与对照组相比差异无统计学意义。2、SSH结果:获得9个上调表达的基因,其中5个为已知基因的部分序列,1个为新EST序列,此基因表达均是在母婴分离的基础上获得。结论母婴分离可降低雌性大鼠的场景恐惧记忆的保持,可能原因是雌性大鼠在面对应激时皮质酮分泌较多,增强对HPA轴的反馈抑制。并且母婴分离可影响某些基因的表达,而这些基因表达水平的变化很可能与雌性大鼠成年后场景性恐惧记忆易感性降低有关。

全文目录

摘要  3-5
ABSTRACT  5-10
英文缩写一览表  10-11
第一章前言  11-17
  1.1 PTSD的易感性研究  11-12
  1.2 PTSD相关的脑区  12-13
  1.3 PTSD动物模型  13
  1.4 生命早期应激与成年后PTSD  13-15
  1.5 PTSD候选基因关联的研究  15
  1.6 PTSD相关基因筛选的研究  15-17
第二章母婴分离幼鼠成年后空间学习记忆及场景性恐惧记忆检测  17-30
  2.1 材料与方法  17-19
    2.1.1 实验动物  17
    2.1.2 母婴分离动物模型制备  17-18
    2.1.3 成年后行为学检测  18-19
    2.1.4 统计学处理  19
  2.2 结果  19-28
    2.2.1 哺乳期母婴分离组及正常组大鼠体重  19-20
    2.2.2 母婴分离组与正常组大鼠场景性恐惧记忆行为学结果  20-23
    2.2.3 Morrris水迷宫测试  23-28
  2.3 讨论  28-30
第三章母婴分离大鼠场景性恐惧记忆易感性差异CA1 区相关基因CDNA文库的构建和筛选  30-59
  3.1 材料与方法  30-45
    3.1.1 主要实验设备  30-31
    3.1.2 主要试剂与药品  31-32
    3.1.3 步骤与方法  32-45
    3.1.4 生物信息学分析  45
  3.2 结果  45-51
    3.2.1 母婴分离组和正常组大鼠成年后体重检测  45
    3.2.2 大鼠海马CA1 区组织总RNA质量及纯度的鉴定  45-46
    3.2.3 抑制消减杂交  46-47
    3.2.4 反向Northern杂交  47-48
    3.2.5 测序结果  48-50
    3.2.6 同源性比较  50-51
  3.3 讨论  51-59
    3.3.1 SSH应用中的体会  51-54
    3.3.2 母婴分离组与正常组大鼠CA1 场景性恐惧记忆相关差异表达基因  54-59
附图  59-69
参考文献  69-78
结论  78-79
综述  79-85
  参考文献  82-85
个人简历  85-86
致谢  86

母婴分离大鼠恐惧记忆易感性差异表达基因的筛选

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