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壳聚糖—藻酸盐支架复合BMSCs修复脊髓损伤的实验研究

作　者: 汪大彬
导　师: 文益民
学　校: 兰州大学
专　业: 外科学
关键词: 组织工程脊髓壳聚糖藻酸盐 BMSCs 急性脊髓损伤大鼠
分类号: R651.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

背景：脊髓损伤(Spinal cord injury, SCI)是骨科领域的常见创伤,通常导致严重的神经功能障碍和残疾,不仅影响个人生理和心理健康,同时对家庭和社会造成严重负担。随着交通、工矿、体育及建筑业的日益发达,其发生率有逐年上升的趋势。2004年,美国脊髓损伤统计中心报告：美国每年就有超过11000例新发病例,全世界SCI每年发生率是15-40例/百万。脊髓损伤以往被认为是不可能治愈的疾病,长期以来人们对SCI后截瘫治疗一直持悲观态度,近年来有关SCI的基础研究的发展,加深了对脊髓损伤后,脊髓再生修复相关因素的认识。分子生物学,细胞生物学等学科的发展为SCI的治疗提供了新的手段,为人类SCI的成功治疗带来了新的希望,并不断有新的脊髓损伤后的治疗方法应用到临床实验,如周围神经移植、胚胎脊髓移植、神经干细胞移植、骨髓间充质干细胞、嗅鞘细胞移植及多种药物的实验性治疗等,但到目前为止,国内外治疗脊髓损伤的各种方案均未取得满意的临床疗效,世界各国均把脊髓损伤后,如何促进脊髓的再生与功能恢复作为一项难题与研究重点。脊髓组织工程技术的兴起为脊髓损伤后脊髓的修复与功能恢复带来了新的希望,它是将体外培养的种子细胞种植于生物相容性良好、可在体内逐步降解的支架材料中,通过构建见组织工程化脊髓修复脊髓损伤。而作为组织工程三要素“种子细胞、支架材料与合适的细胞营养因子”的选择是利用组织工程技术修复组织损伤的重要问题。本研究以骨髓间充质干细胞为种子细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs),选取天然可降解生物材料：壳聚糖、藻酸盐,将两者通过紫外线照射交联、低压冷冻干燥法制备多通道支架材料,将BMSCs种植于复合支架中构建组织工程化脊髓,探讨其对脊髓损伤的修复作用,以其发现一种脊髓损伤后新的治疗方法。目的：研究壳聚糖-藻酸盐支架复合骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)构建组织工程脊髓,桥接大鼠脊髓半横断损伤断端,促进急性脊髓损伤(spinal cord injury, SCI)修复的作用。方法：取1只成年雄性SD大鼠骨髓,分离、培养BMSCs。采用冷冻干燥法制备壳聚糖-藻酸盐支架,扫描电镜观察结构,用浸提液实验检测毒性。将支架材料与第2代BMSCs以细胞密度1×106个/mL体外复合培养制备组织工程脊髓,于培养后1、3、5d扫描电镜观察其生物相容性。取成年雌性SD大鼠40只制备急性脊髓T9半横断损伤模型,根据修复方法不同随机将大鼠分为4组(n=10)。A组于损伤区植入组织工程脊髓,B组植入单纯支架,C组植入20μL1×107个/mL BMSCs, D组直接缝合硬膜作为空白对照。术后1、2、4、6周采用Basso-Beattie-Bresnahan (BBB)评分评价大鼠后肢运动功能；术后6周取材行麦芽凝集素-辣根过氧化物酶(wheat germagglutinin-horseradish peroxidase, WGA-HRP)神经逆行示踪检测、HE染色和免疫荧光染色检测。结果：扫描电镜观察示壳聚糖-藻酸盐支架呈三维多孔海绵样结构。浸提液实验显示支架材料的细胞毒性等级为0-1级。扫描电镜观察示BMSCs与支架材料复合培养3d后即可黏附于支架材料表面,细胞呈一定方向排列。术后2、4、6周A组BBB评分均明显高于其余各组,D组明显低于其余各组,差异均有统计学意义(P<0.05)；B组术后4、6周高于C组(P<0.05)。术后6周,各组WGA-HRP神经逆行示踪检测示阳性神经纤维均未能穿过脊髓断端。HE染色与免疫荧光染色显示A组宿主脊髓与组织工程脊髓连接紧密,损伤区内无明显瘢痕组织长入,有较多神经丝蛋白200 (neurofilament 200, NF-200)阳性细胞发生的神经纤维及神经元特异性烯醇化酶(neuron specific enolase, NSE)阳性神经元样细胞；B组支架植入外周可见成纤维细胞形成的瘢痕组织以及少量侵入尚未降解的支架材料；交界区可见少量NSE、NF-200阳性细胞；C、D组脊髓断端见瘢痕组织填充,D组脊髓损伤周边有空洞形成,两组均未见明显NSE、NF-200阳性神经元样细胞。结论：壳聚糖藻酸盐支架与骨髓间充质干细胞(BMSCs)复合构建的组织工程脊髓对大鼠急性SCI修复有促进作用,是一种具有潜在应用前景的支架材料。

全文目录

英文缩略词表  4-5
中文摘要  5-7
英文摘要  7-12
引言  12-17
材料与方法  17-26
  材料  17-19
    1 实验动物  17
    2 主要实验仪器  17
    3 主要实验试剂  17-18
    4 主要溶液及试剂的配制  18-19
  方法  19-26
    1 骨髓间充质干细胞的分离与培养(贴壁法)  19-21
    2 壳聚糖-藻酸盐复合支架的构建及支架性能测定  21-22
    3 组织工程化脊髓的构建  22
    4 急性脊髓损伤动物模型的制备与移植  22-23
    5 大鼠急性脊髓半横断损伤修复结果的检测  23-26
    6 统计学方法  26
结果  26-31
  1 骨髓间充质干细胞原代培养细胞形态观察  26-27
  2 MTT法测骨髓间充质干细胞的增殖率结果  27
  3 Hoechst 33342标记的骨髓间充质干细胞的形态观察  27-28
  4 壳聚糖-藻酸盐支架观察  28
  5 壳聚糖-藻酸盐支架毒性评价  28
  6 组织工程化脊髓的结构观察  28
  7 组织移植后的实验结果  28-31
    7.1 实验动物大体情况  29
    7.2 运动功能的评价  29
    7.3 麦芽凝集素-辣根过氧化物酶(WGA-HRP)神经逆行示踪结果  29-30
    7.4 脊髓损伤移植区HE染色结果  30
    7.5 免疫荧光检查结果  30-31
讨论  31-36
结论  36-37
文章图片  37-42
参考文献  42-47
研究生在读期间发表文章  47-48
致谢  48

壳聚糖—藻酸盐支架复合BMSCs修复脊髓损伤的实验研究

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