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中棉所36 cDNA文库大规模EST测序及花粉发育特异基因克隆

作　者: 李怀珠
导　师: 喻树迅
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 作物遗传育种
关键词: EST测序花粉特异基因 GhAS1 Cre/loxP RNAi
分类号: S562
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 60次
引　用: 2次
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内容摘要

cDNA文库大规模EST测序是快速发现新基因、大量获得EST及功能基因组学研究的重要方法;为了研究棉花花发育机理,开发早熟基因资源,本文通过对中绵所36花发育均一化cDNA文库EST测序获得了大量的花发育相关EST,生物信息学分析从中发现了花粉特异基因,而花粉特异基因的研究在阐明花粉发育机理、应用雄性不育进行杂交育种方面具有重要意义。通过对花粉特异基因克隆及功能研究,本研究获得的主要研究结果如下:1.通过cDNA文库大规模EST测序,获得了7072条高质量EST,6246条Unigene,去掉载体后EST平均长度为483.5bp,测序的重复率为11.36%。这弥补了目前国际上缺少陆地棉花期相关EST序列的不足。为棉花功能基因组学研究,重要花发育基因资源开发奠定良好基础。2.生物信息学分析从EST数据中发现了一批重要的调控花发育的基因资源,并发现了5个花粉特异基因。3.构建了5个棉花染色体步移文库,将在基因启动子,内含子等旁侧序列克隆中发挥重要作用。4.克隆了一个花粉特异基因命名为GhAS1,通过染色体步移克隆了花粉特异基因GhAS1的启动子和下游调控序列共3002bp,Genbank注册号(HM021767)。5.通过QRT-PCR研究清楚了GhAS1的时空表达模式,发现这个基因具有花粉特异性,为后面利用此基因和花粉特异启动子开发利用奠定了基础。6.分子功能预测及分析显示GhAS1编码的蛋白具有典型的信号肽,跨膜区,具有亲水性,亚细胞定位于是胞外,功能域分析表明这个基因属于花粉变应原家族,同源比对分析推测这个基因的功能是促进花分管萌发的水和蛋白,在花粉发育后期高调表达。7.在克隆棉花花粉发育特异基因GhAS1的基础上,结合花粉特异启动子LAT52和Cre/loxP重组酶体系,构建成通用型RNAi表达载体pCALOXRI,使启动子、GhAS1基因正义片段,反义片段及AF内含子连接成干涉表达盒后置于两个同向的loxP位点之间,以便Cre酶高效删除此表达盒。此体系把Cre/loxP系统的高效重组能力,特异启动子控制基因时空表达的特点,RANi高度专一性、高效性三个特点结合于一体,目的是构建一个研究花粉发育基因通用的体系,并为人工创制雄性不育系及恢复系奠定良好基础。8.通过花粉管通道法转基因,进行GhAS1基因过量表达和RNA干涉研究,两个受体材料中99668和中棉所36分别获得1625g和497g转基因种子,田间卡那霉素鉴定在进行中。

全文目录

摘要  5-7
ABSTRACT  7-12
第一章文献综述  12-32
  1.1 植物花粉发育  12-16
    1.1.1 花粉发育过程  12-14
    1.1.2 花粉发育相关基因的克隆与研究  14-15
    1.1.3 花粉发育基因研究的意义  15
    1.1.4 展望  15-16
  1.2 转基因植物雄性不育研究进展  16-17
    1.2.1 雄性不育类型  16
    1.2.2 雄性不育败育表现  16
    1.2.3 植物基因工程技术在雄性不育上的应用  16-17
  1.3 cDNA 文库  17-19
    1.3.1 cDNA 文库的构建  17-18
    1.3.2 cDNA 文库的应用  18-19
    1.3.3 cDNA 文库存在的问题  19
    1.3.4 cDNA 文库前景展望  19
  1.4 EST 技术及其应用  19-21
    1.4.1 EST 技术的原理  20
    1.4.2 EST 的应用  20-21
  1.5 陆地棉cDNA 文库及大规模EST 测序研究进展  21-23
    1.5.1 陆地棉cDNA 文库EST 数目范围  21-22
    1.5.2 文库包含的器官类型  22
    1.5.3 国内外比较  22-23
  1.6 RNAi  23-26
    1.6.1 RNAi 机制  23
    1.6.2 RNAi 特点  23-24
    1.6.3 RNAi 的研究方法  24-25
    1.6.4 RNAi 的应用  25-26
    1.6.5 RNAi 研究展望  26
  1.7 植物启动子的研究进展  26-28
    1.7.1 启动的类型  26-27
    1.7.2 启动子克隆方法  27
    1.7.3 启动子功能和结构的研究方法  27-28
    1.7.4 问题与展望  28
  1.8 Cre/loxP 重组系统特性  28-30
    1.8.1 Cre/loxP 来源  28-29
    1.8.2 Cre/loxP 系统工作机制  29
    1.8.3 Cre/loxP 系统的特点  29
    1.8.4 Cre/loxP 系统在植物研究上的应用  29-30
    1.8.5 Cre/loxP 系统的问题与展望  30
  1.9 本研究目的和意义  30-32
第二章 EST 测序分析  32-40
  2.1 材料与方法  32-33
    2.1.1 实验材料与试剂  32
    2.1.2 方法  32
    2.1.3 生物信息学分析  32-33
  2.2 结果与分析  33-37
    2.2.1 有效EST 的获得  33-35
    2.2.2 EST 序列拼接  35-36
    2.2.3 基因注释  36
    2.2.4 基因功能分类  36
    2.2.5 重要功能基因挖掘  36-37
  2.3 讨论  37-38
    2.3.1 EST 测序生物信息学分析  37-38
    2.3.2 发现的重要花发育基因  38
  2.4 问题及展望  38-40
第三章棉花花粉发育特异基因克隆及功能鉴定  40-70
  3.1 材料与方法  40-41
    3.1.1 实验材料  40-41
    3.1.2 试剂、酶及试剂盒  41
    3.1.3 实验仪器设备  41
  3.2 实验方法  41-52
    3.2.1 DNA 和RNA 提取  41-43
    3.2.2 染色体步移文库构建  43-45
    3.2.3 基因克隆  45-50
    3.2.4 序列生物信息学分析  50
    3.2.5 基因时空表达模式研究  50-51
    3.2.6 表达载体构建  51-52
    3.2.7 花粉管通道法转基因  52
  3.3 结果与分析  52-69
    3.3.1 DNA 提取  52-53
    3.3.2 RNA 提取  53
    3.3.3 反转录  53-54
    3.3.4 GhAS1 基因全长克隆  54-62
    3.3.5 GhAS1 基因调控序列克隆  62-63
    3.3.6 生物信息学分析  63-64
    3.3.7 荧光定量PCR 结果  64-68
    3.3.8 表达载体构建  68
    3.3.9 花粉管通道法转基因  68-69
  3.4 讨论  69-70
第四章 Cre/loxP 系统调控的RNA 干涉载体构建  70-80
  4.1 材料与方法  70-75
    4.1.1 实验材料与试剂  70-71
    4.1.2 方法  71-75
  4.2 结果与分析  75-79
    4.2.1 DNA 和RNA 提取及RT-PCR  75
    4.2.2 RNAi 载体元件克隆  75
    4.2.3 RNAi 载体构建  75-79
  4.3 讨论  79-80
第五章展望  80-81
参考文献  81-86
英文缩略表  86-87
致谢  87-89
作者简介  89

中棉所36 cDNA文库大规模EST测序及花粉发育特异基因克隆

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