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巴西固氮螺菌Yu62在小麦中的定殖以及对小麦的促生作用

作　者: 王庆贺
导　师: 郭蔼光；刘华伟
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 固氮螺菌 EGFP 荧光显微镜定殖
分类号: S512.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 91次
引　用: 2次
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内容摘要

利用增强型绿色荧光蛋白EGFP基因作为报告基因对巴西固氮螺菌Yu62进行标记。首先将质粒pEGFP-C1中EGFP基因克隆至原核表达载体pVK-100上,构建重组质粒pVK-EGFP,此质粒中含有固氮螺菌复制子,可在巴西固氮螺菌Yu62中稳定复制。然后利用电转化法将重组质粒pVK-EGFP转入巴西固氮螺菌Yu62中,通过聚丙烯酰胺凝胶电泳对绿色荧光蛋白表达情况进行检测,结果表明EGFP基因在巴西固氮螺菌Yu62中能稳定表达,获得EGFP标记的菌株。在限菌条件下,用标记菌株侵染小麦(小偃107)露白种子,取接菌1、3、5、7、30天后的小麦幼苗,经75%乙醇和1%次氯酸钠表面消毒后置于含四环素的YMA培养基上贴板培养,进行固氮菌的分离以及固氮菌在小麦中的初步定位。培养48小时后于波长为365nm紫外灯观测,结果表明,随着接菌时间的推移,小麦发荧光部位由根尖生长点逐步向上蔓延,直至茎部和叶部。另取接菌相同天数的小麦制作切片,用荧光显微镜观测固氮菌在小麦内的定殖规律。结果显示,在接菌后的第1天,标记菌株主要定殖根表面。在接菌后的第3天,标记菌株进入到小麦根的皮层,主要位于细胞间隙。在接菌后的第5天,标记菌进入内皮层,少数菌株进入到维管束。在接菌后的第7天,大量菌株进入到维管束,导管内有少量标记菌的侵入。在接菌后的第30天发现在茎、叶中有标记菌定殖,结果表明固氮菌可以由根部向地上部位迁移。在开放条件下,将挑选出籽粒饱满的小麦(小偃107)分为两组,其中一组以巴西固氮螺菌Yu62作为菌肥,与小麦(小偃107)作拌种试验,拌种方法为:将培养至OD值约为0.6的巴西固氮螺菌菌液浸泡小麦种子,浸泡时间为2h,浸泡后将接菌小麦和不做任何处理的对照小麦种于田间,种植时沟宽0.2m,每行小麦均匀种植,保证接菌小麦和对照在数量上基本一致。在接菌五个月后对小麦观测,结果表明接菌小麦在株高以及叶片颜色上比对照小麦更高、更绿。在接菌七个月后对小麦观测,结果表明接菌小麦在株高、分蘖数以及根系发达程度上比对照小麦都有较大优势。从中可以得到以下结论:巴西固氮螺菌作为禾本科植物内生固氮菌对植物有明显的促生作用。

全文目录

摘要  6-7
ABSTRACT  7-11
第一章文献综述  11-25
  1.1 经济植物固氮的意义  11
  1.2 联合固氮在禾本科植物中的研究  11-19
    1.2.1 联合固氮机理  11-13
    1.2.2 非豆科植物内生菌的种类  13-15
    1.2.3 内生菌的生物学作用  15
    1.2.4 内生菌提高植物抗逆性机制  15-17
    1.2.5 内生固氮菌在小麦上的应用  17-18
    1.2.6 对内生固氮在农业上应用的展望  18-19
  1.3 绿色荧光蛋白的性质及改进方法  19-22
    1.3.1 GFP 的一般性质  19
    1.3.2 GFP 发光原理  19-20
    1.3.3 GFP 的应用优点  20
    1.3.4 GFP 的改进原理  20-21
    1.3.5 GFP 的改进方法  21-22
  1.4 绿色荧光蛋白的应用  22-24
    1.4.1 基因表达的研究  22
    1.4.2 荧光标记在细胞中的应用  22-23
    1.4.3 活细胞内蛋白的定位研究  23
    1.4.4 绿色荧光蛋白在探针中的应用  23-24
  1.5 本试验的目的和意义  24-25
第二章 pVK-EGFP 重组质粒的构建  25-36
  2.1 试验材料、所用仪器和试剂  25-27
    2.1.1 菌株和质粒  25
    2.1.2 抗生素  25
    2.1.3 酶与试剂  25
    2.1.4 主要仪器  25
    2.1.5 培养基类  25-26
    2.1.6 碱裂解法手提质粒所用试剂  26
    2.1.7 电泳类试剂及配制方法  26-27
  2.2 试验方法  27-31
    2.2.1 重组载体构建  27-29
    2.2.2 重组载体转化大肠菌株DH5α  29
    2.2.3 重组载体转化巴西固氮螺菌Yu62  29-30
    2.2.4 EGFP 基因在巴西固氮螺菌Yu62 中的诱导表达  30-31
  2.3 结果与分析  31-35
    2.3.1 EGFP 全长基因的PCR 扩增  31-32
    2.3.2 重组质粒菌落PCR 验证  32
    2.3.3 重组质粒pVK-EGFP 构建示意图  32-33
    2.3.4 重组质粒的双酶切鉴定  33-34
    2.3.5 EGFP 基因在巴西固氮螺菌Yu62 中的表达  34
    2.3.6 EGFP 标记的巴西固氮螺菌Yu62 在平板上的检测  34-35
  2.4 讨论  35-36
第三章固氮螺菌在小麦内的定殖及对小麦的促生作用  36-43
  3.1 试验材料和所用仪器  36
    3.1.1 植物材料  36
    3.1.2 菌株  36
    3.1.3 主要仪器  36
  3.2 试验方法  36-37
    3.2.1 限菌条件下植物材料的生长  36
    3.2.2 固氮菌的培养及对小麦的转接试验  36
    3.2.3 荧光标记固氮菌的分离及平皿试验  36
    3.2.4 荧光显微镜观测样品的制备  36-37
    3.2.5 荧光检测和图像分析  37
    3.2.6 在田间试验中比较接种小麦与对照间的差异  37
  3.3 结果与分析  37-41
    3.3.1 无菌条件下小麦材料的培养  37
    3.3.2 标记菌株的初步分离  37-39
    3.3.3 分离出标记菌的菌落PCR 鉴定  39
    3.3.4 巴西固氮螺菌Yu62 在小麦中的定殖  39-40
    3.3.5 巴西固氮螺菌Yu62 对小麦的促生作用  40-41
  3.4 讨论  41-43
第四章结论与创新  43-44
  4.1 结论  43
  4.2 创新  43-44
参考文献  44-48
附录  48-49
致谢  49-50
作者简介  50

巴西固氮螺菌Yu62在小麦中的定殖以及对小麦的促生作用

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