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反义RNA对丙型肝炎病毒基因表达的抑制作用研究

作　者: 陈中湘
导　师: 刘水平
学　校: 中南大学
专　业: 医学微生物学
关键词: 丙型肝炎病毒复制子 EGFP Huh-7细胞反义RNA
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

背景与目的：丙型肝炎病毒是一条有包膜的单股正链RNA病毒,属于丙型肝炎病毒属黄病毒科,是丙型肝炎的主要病原体。慢性感染常常演变成肝硬化和肝细胞癌。目前尚无针对HCV的预防或治疗性疫苗,较为认可的治疗方案是干扰素联合应用利巴韦林,但治疗的病毒学应答率仅在50%左右。因此,寻找更为安全有效的抗HCV治疗方法已成为迫在眉睫的问题。HCV基因治疗方法已成为近几年来的研究热点,分子技术如反义核酸以及RNA干扰技术在基础和临床研究方面已取得了一些进展。为探讨反义核酸对HCV的作用,本研究构建重组HCV复制子真核表达质粒pHCV-EGFP并在Huh-7细胞中复制表达,再通过反义EGFP转染观察其对HCV复制的影响,为寻找新的抗HCV方法提供有效平台和实验依据。方法：(1)用增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因替代HCV基因组中的包膜基因(E1和E2),体外构建重组HCV复制子真核表达质粒pHCV-EGFP,经限制性内切酶酶切分析和测序结果证明重组HCV复制子中未发生EGFP和HCV编码区读码框架改变。(2)脂质体介导转染人肝癌细胞系Huh-7细胞,荧光显微镜观察和半定量RT-PCR方法证实该重组HCV复制子在Huh-7真核细胞中能有效复制并表达EGFP蛋白。(3)以人肝癌Huh-7细胞株为研究对象,脂质体介导将pHCV-EGFP和反义EGFP质粒共转染Huh-7细胞,同时设三组对照组：正义EGFP和HCV-EGFP复制子质粒、HCV-EGFP复制子质粒、未转染质粒的空白对照,荧光显微镜和Western blot检测EGFP蛋白表达,半定量RT-PCR检测HCVRNA的复制情况。结果：(1)酶切和测序证明正确构建了重组真核表达质粒HCV-EGFP,并证实该质粒能在Huh-7真核细胞中正确表达和有效复制。(2)反义EGFP质粒转染组的EGFP蛋白表达较对照组明显下调,HCV RNA的复制较对照组显著减少(p<0.05)。结论：(1)成功构建了HCV-EGFP的真核表达质粒载体,并在Huh-7细胞中表达,为在Huh-7细胞模型中进一步研究HCV的复制和致病机制提供了有效技术平台。(2)反义EGFP能抑制HCV的复制和蛋白表达,为探索抗HCV治疗提供了可行性和实验依据。

全文目录

中文摘要  4-5
英文摘要  5-7
目录  7-8
英汉缩略词对照表  8-9
前言  9-14
第一章材料与方法  14-37
  1.1 实验材料  14-17
  1.2 实验方法  17-37
第二章结果  37-49
  2.1 AgeI片段的PCR和pcDNA3.1(+)-AgeI载体的酶切鉴定  37
  2.2 pcDNA3.1(+)-AgeI载体的测序鉴定  37-38
  2.3 EGFP片段的PCR和pcDNA3.1(+)-AgeI-EGFP载体的酶切鉴定  38-39
  2.4 pcDNA3.1(+)-AgeI-EGFP载体的测序鉴定  39-40
  2.5 AfⅢ片段的PCR和pcDNA3.1(+)-AgeI-EGFP-AfⅢ载体的鉴定  40-41
  2.6 pcDNA3.1(+)-AgeI-EGFP-AfⅢ载体的测序鉴定  41
  2.7 HCV-EGFP载体的酶切鉴定  41-42
  2.8 HCV-EGFP载体的测序鉴定  42-44
  2.9 荧光显微镜检测HCV-EGFP复制子在Huh-7细胞中的EGFP蛋白表达  44
  2.10 RT-PCR检测HCV-EGFP复制子在Huh-7细胞中的复制  44-45
  2.11 RT-PCR检测反义EGFP质粒在Huh-7细胞中的转录  45-46
  2.12 荧光显微镜检测反义EGFP质粒对HCV-EGFP复制子在Huh-7细胞中的EGFP蛋白表达影晌  46-47
  2.13 半定量RT-PCR检测反义EGFP质粒对HCV-EGFP复制子的复制影晌  47-48
  2.14 Western blot检测反义EGFP质粒对HCV-EGFP在Huh-7中的EGFP蛋白表达的影响  48-49
第三章讨论  49-53
第四章结论  53-54
参考文献  54-57
综述  57-66
致谢  66-67
攻读学位期间的主要成果  67

反义RNA对丙型肝炎病毒基因表达的抑制作用研究

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