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HBD-3基因乳腺特异性载体的构建及真核表达

作　者: 彭巍
导　师: 张涌
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 临床兽医学
关键词: 人β-防御素3 奶牛β-酪蛋白 EGFP报告基因供体细胞核移植
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

转基因动物乳腺反应器是一种利用转基因技术在动物乳腺中特异性表达多肽药物、疫苗、抗体等蛋白的技术。利用乳腺生物反应器生产重组蛋白具有效率高、成本低廉等优点,并且表达的重组蛋白具有天然生物活性。由于HBD-3在人体正常组织中的含量很少,分离纯化难度较大,通过提取所能获得的HBD-3的量是极其有限的。而化学合成成本太高,耗资巨大,因此通过基因工程技术来获得大量的抗菌肽HBD-3成为首选之路。虽然通过原核表达系统获得的重组HBD-3在抗菌活性、生化特征上与提取的天然HBD-3毫无差异,但以往进行的抗菌肽重组表达研究普遍存在表达量和活性偏低的现象。这可能是因为真核基因在原核细胞中表达时,密码子使用频率不同;也可能是因为在大肠杆菌中表达的产物常以包涵体形式存在,纯化后的蛋白还需要进一步的复性才具有活性。因此,本研究采用奶牛乳腺上皮细胞真核表达系统,通过RT-PCR获得HBD-3 cDNA 45个成熟肽,分离纯化PCR产物,链接到pMD-19载体,转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆pMhD ,并对其进行酶切鉴定和序列测定。结果表明,所克隆的HBD-3基因为210 bp。将HBD-3基因插入到牛β-酪蛋白启动子5’调控区和3’端调控区之间,构成重组质粒pBCD,利用SacI/SacII双酶切质粒pBCD得到3.0kb的BCD基因片段,与经同样双酶切的真核表达载体pEGFP-C1进行定向连接,获得以牛β-酪蛋白启动子为调控序列,增强型绿色荧光蛋白(Enhancer Green Fluorescent Protein,EGFP)为报告基因的HBD-3基因乳腺表达载体pEBCD。最终将构建成功的表达载体通过脂质体法转染奶牛胎儿成纤维细胞和乳腺上皮细胞,转染24-48 h后,在倒置显微镜下观察转染效率;用G418进行抗性细胞克隆的药物筛选,2周后,提取G418抗性细胞克隆的基因组DNA和细胞总RNA,用PCR和RT-PCR方法检测出阳性转基因细胞克隆,鉴定转基因细胞是否整合到细胞的基因组中,以便最终为通过乳腺生物反应器生产药用蛋白的转基因动物提供核移植供体细胞,然后扩大培养,冻存阳性细胞,为下一步进行核移植提供供体细胞;同时,将构建的表达载体转染奶牛乳腺上皮细胞,筛选阳性克隆进行扩大培养,加入胰岛素,氢化可的松和催乳素进行诱导表达。诱导48 h后,收获上清液,超滤浓缩目的蛋白进行Western blot检测分析。进而证实目的基因HBD-3能够整合到宿主细胞的基因组上,从而使其能以β-酪蛋白为启动子得以到高效表达,利于蛋白的纯化,进而为通过利用动物乳腺生物反应器生产药用蛋白奠定基础。

全文目录

摘要  5-6
ABSTRACT  6-11
综述部分  11-25
  第一章 HBD-3 的研究进展  11-17
    1.1 HBD-3 的结构  11-12
    1.2. HBD-3 基因的表达调控  12-13
    1.3 HBD-3 的抗菌作用机理  13
    1.4. HBD-3 的生物学功能  13-15
      1.4.1 抗菌作用  13-14
      1.4.2 抑制真菌、病毒作用  14-15
      1.4.3 HBD-3 的免疫学活性  15
    1.5 HBD-3 的基因工程研究  15-16
    1.6 结语  16-17
  第二章转基因动物应用的现状及前景  17-25
    2.1 转基因动物的应用  17-22
      2.1.1 转基因动物在医学上的应用  17-19
      2.1.2 转基因动物在农业上的应用  19-21
      2.1.3 转基因动物及抗病性  21-22
    2.2 转基因动物制作方法  22-24
      2.2.1 显微注射法  22
      2.2.2 逆转录病毒感染法  22
      2.2.3 精子载体法  22-23
      2.2.4 胚胎干细胞介导法  23
      2.2.5 人工酵母染色体法  23
      2.2.6 体细胞核移植法  23-24
    2.3 结语  24-25
实验部分  25-49
  第三章 HBD-3 基因的克隆及鉴定  25-30
    3.1 材料和方法  25-27
      3.1.1 材料  25-26
      3.1.2 方法  26-27
    3.2 结果与分析  27-29
      3.2.1 总RNA 的完整性  27-28
      3.2.2 HBD-3 的PCR 扩增及重组质粒酶切鉴定  28-29
      3.2.3 HBD-3 基因序列测定结果  29
    3.3 讨论  29-30
  第四章乳腺特异性表达载体PEBCD 的的构建  30-38
    4.1 材料和方法  30-33
      4.1.1 材料  30-31
      4.1.2 方法  31-32
      4.1.3 初级乳腺载体构建  32
        4.1.3.1 引物设计  32
        4.1.3.2 PCR 扩增  32
        4.1.3.3 hd 的亚克隆和酶切鉴定  32
        4.1.3.4 初级乳腺载体pBCD 构建  32
      4.1.4 乳腺特异性表达载体pEBCD 的构建  32-33
    4.2 结果与分析  33-37
      4.2.1 β-酪蛋白5’调控序列的PCR 扩增及亚克隆酶切鉴定  33-34
      4.2.2 β-酪蛋白3’调控序列的PCR 扩增及亚克隆酶切鉴定  34-35
      4.2.3 改建重组质粒pBCP 的酶切鉴定  35-36
      4.2.4 重组质粒pMhD 的酶切鉴定  36
      4.2.5 初级乳腺载体pBCD 的酶切鉴定  36
      4.2.6 乳腺特异性表达载体pEBCD 的酶切鉴定  36-37
    4.3 讨论  37
    4.4 小结  37-38
  第五章乳腺特异性表达载体的真核转染及检测分析  38-49
    5.1 材料和方法  38-45
      5.1.1 材料  38-39
      5.1.2 方法  39-45
    5.2 结果  45-47
      5.2.1 转染胎儿成纤维上皮细胞和乳腺上皮细胞的G418 抗性筛选  45
      5.2.2 转染效率的检测  45-46
      5.2.3 阳性细胞PCR 鉴定及RT-PCR 鉴定  46-47
      5.2.4 诱导产物的Western blotting 检测  47
    5.3 讨论  47-48
    5.4 小结  48-49
结论  49-50
参考文献  50-58
附录1 试验仪器  58-59
附录2 试验试剂及配制方法  59-62
缩略语  62-63
致谢  63-64
作者简介  64

HBD-3基因乳腺特异性载体的构建及真核表达

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