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玉米大斑病菌2A型蛋白磷酸酶基因的克隆与功能分析

作　者: 郝杰
导　师: 董金皋
学　校: 河北农业大学
专　业: 植物学
关键词: 玉米大斑病菌 PP2A 斑蝥素基因敲除
分类号: S435.131
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

由玉蜀黍大斑刚毛座腔菌(Setosphaeria turcica)引起的玉米大斑病是玉米生产上的重要病害之一,其发生和流行,不仅造成严重的经济损失,而且降低了玉米的品质。研究表明,许多植物病原真菌的生长、发育都受细胞跨膜信号转导途径的调控,如MAPK信号途径、cAMP信号途径及Ca2+信号途径等。研究信号转导途径对玉米大斑病菌生长和发育的调控作用,有利于深入了解病菌的发育和侵染寄主的分子机制,对研究病原真菌与寄主植物之间的互作以及植物病害防治也具有重要的理论意义。PP2A是一种主要的丝/苏氨酸磷酸酶, PP2As已被证实通过调控某些基因的转录、RNA拼接及翻译过程,对不同生物的信号转导、新陈代谢以及细胞周期方面发挥重要的作用。为了明确PP2A与玉米大斑病菌分生孢子萌发、附着胞形成及致病性之间的关系,实验利用PP2A特异性抑制剂—斑蝥素(Cantharidin)初步研究了玉米大斑病菌PP2A的功能。结果显示,Cantharidin对玉米大斑病菌菌丝生长及分生孢子的萌发均具有明显的抑制作用,且抑制率随抑制剂浓度升高而增强;并且可引起芽管的缩短和不规则膨大。此外,Cantharidin也可以导致病菌粗毒素的生物学活性明显降低。由此说明PP2A可以通过影响菌丝及芽管的极性生长,而调控玉米大斑病菌的菌丝及分生孢子发育;同时参与病菌的毒素合成。根据已知植物病原真菌PP2A-C和PP2A-B基因的保守核苷酸序列设计简并性引物,以玉米大斑病菌基因组DNA为模板,扩增获得了PP2A-C和PP2A-B基因的同源片段。利用Genome Walking技术对所得的基因片段进行延伸,获得了1600 bp的全长PP2A-C基因和2425 bp PP2A-B基因片段。Southern杂交技术确定了PP2A-C基因在玉米大斑病菌基因组中以单拷贝形式存在。为进一步研究基因功能,试验构建了PP2A-C基因的同源重组型基因敲除载体。对PP2A-C基因的基因敲除载体质粒利用PEG介导法转化玉米大斑病菌的原生质体,潮霉素筛选共获得了15个稳定的转化子。以潮霉素磷酸转移酶基因hph为探针,经Southern杂交验证,确定了转化子E为突变体。对E突变体进行表型分析,发现其生长速率和致病性明显降低。以上结果表明玉米大斑病菌PP2A基因对病菌形态建成、分生孢子萌发、附着胞形成、致病性有调空作用。为进一步研究玉米大斑病菌的致病机理以及植物与病原物分子互作和开发新的植物病害防治方法奠定了基础。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-10
1 引言  10-13
  1.1 玉米大斑病菌  10
  1.2 2A 型蛋白磷酸酶  10-11
  1.3 基因敲除  11-13
2 材料和方法  13-27
  2.1 试验材料  13-15
    2.1.1 菌株和质粒  13
    2.1.2 主要试剂  13
    2.1.3 供试培养基及试剂配制  13-14
    2.1.4 主要仪器  14-15
  2.2 抑制剂实验  15
    2.2.1 斑蝥素的配制  15
    2.2.2 玉米大斑病菌菌丝生长情况的观察  15
    2.2.3 玉米大斑病菌分生孢子萌发率的统计  15
  2.3 玉米大斑病菌PP2A 基因的克隆  15-19
    2.3.1 玉米大斑病菌基因组DNA 及总RNA 的提取  15-16
    2.3.2 引物设计  16-17
    2.3.3 病菌PP2A 基因DNA 同源片段的获得  17-18
    2.3.4 PCR 产物的纯化  18
    2.3.5 PCR 扩增产物与pMD-19 载体的连接，转化和克隆测序  18-19
  2.4 基因侧翼序列的获得  19-21
    2.4.1 模板DNA 的制备和引物的设计  19-20
    2.4.2 Genome walking PCR 扩增  20-21
  2.5 PP2A 基因的生物信息学分析  21
  2.6 PP2A-C 基因的拷贝数分析  21-22
    2.6.1 探针制备  21
    2.6.2 酶切  21
    2.6.3 电转移  21-22
    2.6.4 Southern Blotting  22
    2.6.5 免疫检测  22
  2.7 PP2A-C 基因同源重组载体的构建  22-24
  2.8 转化子的PCR 筛选  24-25
  2.9 玉米大斑病菌PP2A-C 基因敲除突变体的生物学性状分析  25-27
    2.9.1 PP2A-C 突变菌株菌落、菌丝形态的观察和菌落生长速度测定  25
    2.9.2 PP2A-C 突变菌株产毒力的测定  25-26
    2.9.3 PP2A-C 突变菌株致病力测定  26
    2.9.4 PP2A-C 突变菌株的组织病理学观察  26
    2.9.5 PP2A-C 突变菌株高渗条件下菌丝形态的显微观察  26-27
3 结果与分析  27-49
  3.1 抑制剂对玉米大斑病菌生长发育及致病性的影响  27-30
    3.1.1 斑蝥素对玉米大斑病菌菌丝生长的影响  27
    3.1.2 Cantharidin 对玉米大斑病菌分生孢子萌发的影响  27-29
    3.1.3 斑蝥素对HT-毒素活性的影响  29
    3.1.4 斑蝥素对致病性的影响  29-30
  3.2 基因组DNA 和总RNA 的提取  30
  3.3 PP2A-C 基因的获得  30-33
    3.3.1 玉米大斑病菌PP2A-C 基因DNA 同源片段的扩增  30-31
    3.3.2 PP2A-C 基因全长的获得  31-33
  3.4 PP2A-B 基因的获得  33-35
    3.4.1 玉米大斑病菌PP2A-B 基因DNA 同源片段的扩增  33-34
    3.4.2 PP2A-B 基因全长的获得  34-35
  3.5 PP2A-C 和PP2A-B 基因的生物信息学分析  35-37
  3.6 PP2A-C 基因的拷贝数验证  37-38
  3.7 PP2A-C 的同源重组载体的构建  38-40
  3.8 玉米大斑病菌遗传转化及转化子的筛选  40-43
    3.8.1 重组DNA 片段的PCR 扩增  40-41
    3.8.2 原生质体的再生  41-42
    3.8.3 基因敲除突变体的PCR 验证  42-43
  3.9 玉米大斑病菌PP2A-C 基因的功能分析  43-49
    3.9.1 PP2A-C 基因突变体的性状观察  43
    3.9.2 突变菌株的生长速度确定  43-44
    3.9.3 PP2A-C 突变体菌株在高渗胁迫下的生长形态  44-46
    3.9.4 PP2A-C 突变体菌株在PD 液体培养条件下的生长状态  46-47
    3.9.5 PP2A-C 突变菌株的漆酶活性  47
    3.9.6 突变菌株粗毒素生物学活性的测定  47-48
    3.9.7 PP2A-C 突变菌株的致病力  48-49
4 讨论  49-52
  4.1 PP2A 特异性抑制剂的研究  49
  4.2 PP2A 基因功能分析  49-50
  4.3 PP2A 基因片段全长序列的获得  50-51
  4.4 基因敲除突变体的研究  51-52
5 结论  52-53
参考文献  53-57
在读期间发表的学术论文  57-59
致谢  59-60

玉米大斑病菌2A型蛋白磷酸酶基因的克隆与功能分析

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