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双水相萃取白蛋白和酶的初步研究

作　者: 田明玉
导　师: 修志龙
学　校: 大连理工大学
专　业: 生物化工
关键词: 双水相萃取白蛋白酶二元醇
分类号: TQ932
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

蛋白质和酶在人类日常生活、疾病预防和治疗以及工业生产中都发挥着重要的作用,其提取分离是获取这类物质的必要手段。目前,工业上粗分离蛋白质的主要方法有盐析法、等电点沉淀法和有机溶剂沉淀法。虽然这几种方法都能在一定程度上达到分离的目的,但仍然存在诸多缺点,如操作步骤繁琐,对操作条件要求苛刻,而且分离过程中容易发生蛋白质变性,蛋白分离提取的收率和效率较低。针对这些问题,本论文提出了采用低分子量亲水有机溶剂/无机盐的新型双水相体系对蛋白质进行分离提取。首先,考察了多种单羟基的短链醇/无机盐双水相体系对牛血清白蛋白的萃取能力。结果表明,多种体系对白蛋白都有较好的萃取效果。综合考虑成本、工业可行性、萃取效果,选取了磷酸氢二钾/乙醇和碳酸钠/乙醇体系做进一步的研究。在磷酸氢二钾18%(w/w)/乙醇18%(w/w)、碳酸钠13%(w/w)/乙醇18%(w/w)时,白蛋白收率达到最大分别为94.0%、93.6%,此时的白蛋白分配系数为11.52、11.24,这与传统的低分子量聚乙二醇/磷酸氢二钾体系萃取效果相似。其次,采用萃取能力较强、且受温度和pH影响较小的磷酸氢二钾/乙醇体系对发酵液和牛血液中的白蛋白进行分离提取。在发酵液处理方面,首先考察了对0.2L发酵液的萃取能力,在磷酸氢二钾20%(w/w)/乙醇18%(w/w)时白蛋白回收率和菌体去除率高达93.5%和99.8%;进一步做了放大实验,考察了此体系对2L、23L、50L、73L的发酵液的处理能力,得到的白蛋白收率依次为106.3%、113.2%、98.3%和96.7%;将处理后的上相调节pH4.5后依次过高盐阳离子、疏水和阴离子柱层析进行纯化,纯化后的白蛋白在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳上得到了单一条带,经HPLC分析结果显示纯度为99.71%。当牛血液稀释倍数为9、磷酸氢二钾18%(w/w)和乙醇15%(w/w)时,84.41%的白蛋白被萃取到了上相,而IgG和杂蛋白则大部分被沉淀到了两相界面处,达到了一个较为理想的分离提取效果。最后,采用二元醇/无机盐双水相体系对蛋白质进行分离提取。考察了该体系对白蛋白和多种酶的萃取分离效果,结果白蛋白在保持二级结构不变得前提下,蛋白收率和纯度高达91.1%和85.5%;几种酶都得到了较高的酶比活性保留率和蛋白回收率,分别在83%和73%以上。实验表明,低分子量的亲水有机溶剂/无机盐体系较适合于蛋白质和酶的分离提取,具有良好的应用前景。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-10
引言  10-11
1 文献综述  11-25
  1.1 蛋白质的作用和分离方法  11-18
    1.1.1 蛋白质的性质和用途  11-14
    1.1.2 蛋白质分离的常用方法  14-18
  1.2 双水相萃取技术  18-24
    1.2.1 双水相体系概述  18-19
    1.2.2 双水相体系形成机理  19-20
    1.2.3 双水相体系的相图  20
    1.2.4 双水相体系的特点  20-22
    1.2.5 影响物质分配平衡的因素  22
    1.2.6 双水相萃取技术的应用  22-24
  1.3 本课题的研究内容、方案与意义  24-25
    1.3.1 本课题的研究内容  24
    1.3.2 本课题的研究方案  24
    1.3.3 本课题的研究意义  24-25
2 白蛋白在单羟基短链醇/无机盐体系中的分配特性和规律  25-41
  2.1 引言  25
  2.2 实验材料与仪器  25-26
    2.2.1 实验材料  25-26
    2.2.2 实验仪器  26
  2.3 实验方法  26-29
    2.3.1 牛血清白蛋白溶液的制备  26
    2.3.2 双水相体系相图的绘制  26
    2.3.3 双水相体系萃取能力测定  26-27
    2.3.4 白蛋白在两相间的分配规律的考察  27
    2.3.5 分析方法  27-29
  2.4 结果与讨论  29-40
    2.4.1 双水相体系的相图  29-32
    2.4.2 双水相体系的选择  32-36
    2.4.3 牛血清白蛋白在双水相体系中的分配规律  36-40
  2.5 本章小结  40-41
3 双水相萃取发酵液中的人血清白蛋白  41-47
  3.1 前言  41
  3.2 实验材料与仪器  41-42
    3.2.1 实验材料  41
    3.2.2 实验仪器  41-42
  3.3 实验方法  42
    3.3.1 双水相体系萃取分离发酵液中的白蛋白  42
    3.3.2 双水相上相中自蛋白的分离纯化  42
    3.3.3 分析方法  42
  3.4 结果与讨论  42-46
    3.4.1 双水相体系萃取发酵液中的白蛋白  42-44
    3.4.2 双水相体系放大实验  44-46
  3.5 本章小结  46-47
4 双水相萃取牛血清中的白蛋白  47-57
  4.1 前言  47
  4.2 实验材料与仪器  47-48
    4.2.1 实验材料  47
    4.2.2 实验仪器  47-48
  4.3 实验方法  48-50
    4.3.1 血清的制备  48
    4.3.2 双水相体系萃取分离血清中的白蛋白  48-49
    4.3.3 分析方法  49-50
  4.4 结果与讨论  50-56
    4.4.1 IgG在双水相体系的分配情况  50-51
    4.4.2 血清中的蛋白在双水相体系中的分配情况  51-53
    4.4.3 双水相体系的优化  53-56
  4.5 本章小结  56-57
5 二元醇/无机盐双水相萃取白蛋白和酶的初步研究  57-68
  5.1 前言  57
  5.2 实验材料与仪器  57-58
    5.2.1 实验材料  57-58
    5.2.2 实验仪器  58
  5.3 实验方法  58-63
    5.3.1 双水相体系的制备  58
    5.3.2 分析方法  58-63
  5.4 结果与讨论  63-67
    5.4.1 白蛋白在二元醇/无机盐体系中的分配特性  63-66
    5.4.2 酶在二元醇/无机盐体系中的分配特性  66-67
  5.5 本章小结  67-68
结论  68-69
展望  69-70
参考文献  70-77
攻读硕士学位期间发表学术论文  77-78
致谢  78-79

双水相萃取白蛋白和酶的初步研究

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