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高表达蛋白Mst1对人胚肾HEK293细胞凋亡和增殖的影响

作　者: 李兆明
导　师: 严群
学　校: 华中科技大学
专　业: 普通外科学
关键词: Mst1 四环素诱导表达 质粒构建 MTT hippo
分类号: R346
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
下　载: 55次
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内容摘要


目的建立受四环素诱导表达外源基因Mst1的真核表达体系人胚肾293(HEK293)细胞株,用于进一步基因功能的研究。方法利用T-REx (Tetracycline - Regulated Expression)系统建立四环素可调控的表达体系。首先,构建含有目的基因Mst1的质粒pcDNA4/TO-Mst1。其次,将调节性pcDNA6/TR质粒用脂质体介导法转染人胚肾293细胞,经药物Blasticidin S筛选后的克隆用有限稀释法进行单克隆化。单克隆扩增后再瞬时转染质粒pcDNA4/TO-Mst1并用Zeocin筛选并挑选单克隆。然后经四环素诱导表达,通过Western Blot方法检测目的基因Mst1的表达水平,从而筛选出由四环素诱导的高表达外源基因Mst1的人胚肾293单克隆细胞株。结果通过T-REx系统成功构建由四环素调控的高表达外源基因Mst1的人胚肾293细胞株。结论四环素诱导表达目的基因Mst1的人胚肾293细胞株可用于外源基因的真核调控表达,为研究目的基因Mst1及其它真核基因功能提供了一种有力的实验手段。目的探讨四环素诱导性表达外源性Mst1(Mammalian sterile 20-like kinase 1)对HEK 293细胞增殖与凋亡的影响。方法在已经成功构建的四环素可诱导表达Mst1的HEK 293细胞系中,加入四环素诱导Mst1在HEK293细胞中高表达。通过蛋白Western Blot分析Mst1在HEK 293细胞中的表达情况;分别在加入四环素后12, 24,36,48小时通过四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT)观察高表达Mst1后对细胞增殖的影响;加入四环素后36小时加入BrdU,通过其掺入比率来显示Mst1对细胞增殖的影响;加入四环素后后36小时,加入顺铂作用14小时后通过Annexin V检测其对细胞凋亡的影响。结果四环素成功诱导Mst1高表达;MTT及BrdU结果显示在HEK 293细胞中高表达Mst1后细胞增殖明显受到抑制;Annexin V检测结果提示高表达Mst1后,细胞的凋亡率相对增高。结论在HEK 293细胞中高表达Mst1,不仅可以抑制细胞增殖,还可促进细胞凋亡。

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 人体生物化学、分子生物学
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