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HBx knockdown对HepG2.2.15细胞HBV复制和线粒体钙通道的影响及其表达谱分析

作　者: 谢海洋
导　师: 郑树森
学　校: 浙江大学
专　业: 外科学
关键词: HBV HBx siRNA 钙离子基因表达谱
分类号: R512.62
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

背景：研究表明乙肝病毒(Hepatitis B virus,HBV)第四个阅读框架所编码的蛋白HBx调控着HBV的复制,HBx作为“多功能病毒蛋白”介导的Calcium- PyK2 (calcium-dependent proline-rich tyrosine kinase-2)信号通路是目前明确可影响HBV复制的环节之一,胞内钙通道及钙离子信号可能直接参与了HBV病毒的复制过程,体内外实验证实HBx可与线粒体膜上的钙通道通透性转运孔(Mitochondrial permeability transition pore,MPTP)结合,但其是否影响MPTP的功能及其与病毒复制的相关性有待进一步研究,HBx Knockdown引起HBV复制功能的减低具体机制亦尚不明确。目的：本研究拟通过HBx siRNA下调HBx mRNA表达以期抑制HBV DNA的复制,同时分析线粒体钙通道转运孔与病毒复制的关系；建立HBx Knockdown前后的基因表达谱,为后续的深入相关基因功能和调控机制研究奠定基础。方法：本研究通过合成HBx基因1694起始位点siRNA,转染含HBV全基因组的HepG2.2.15细胞,运用微粒子酶免疫分析技术(MEIA)对HBV表面抗原(HBsAg).e抗原(HBeAg)进行定量检测,Real-time PCR分析HBxmRNA及HBV DNA拷贝数的变化。运用流式细胞仪定量分析胞内线粒体MPTP状态变化引发Calcein激发的荧光强度变化,利用Affymetrix表达谱芯片筛选HBx Knockdown前后的差异表达基因,对部分基因用Real-time PCR进行验证。结果：HBx siRNA1694可明显下调HepG2.2.15细胞HBx mRNA的表达,抑制培养上清HBsAg和HBeAg的表达分泌,减低培养上清HBV DNA拷贝数；HBxsiRNA1694和MPTP抑制剂环孢素A(CsA,Cyclosporine A)可拮抗胞内钙离子释放剂A23187引发的Calcein荧光强度的降低HBx Knockdown前后表达谱芯片结果显示差异2倍(P<0.05)以上的基因有385个,其中在HBx siRNA1694处理后明显下调的有288个基因,97个基因明显上调表达,并对HSPB8、PIK3CB等相关基因进行了验证。结论：HBV X基因1694起始位点siRNA通过下调HBx mRNA的转录可有效抑制HBV复制过程,该HBV病毒复制抑制效应与HBx siRNA (?)抑制线粒体膜通透转运孔的功能密切相关；建立了HBx Knockdown前后表达谱,Real-time PCR对相关基因验证的结果表明,表达谱芯片具有较好的重复性和可靠性,为后期相关基因功能和HBV分子调控机制的深入研究奠定基础。

全文目录

致谢  4-5
中文摘要  5-8
Abstracts  8-11
英文缩写词与中英文索引  11-12
目次  12-13
第一部分 HBx siRNA1694对HepG2.2.15细胞HBV DNA复制及胞内线粒体膜钙通道的影响  13-33
  前言  13-15
  材料与方法  15-22
  结果  22-26
  讨论  26-28
  结论  28-29
  参考文献  29-33
第二部分 HepG2.2.15细胞HBx Knockdown基因表达谱的变化研究  33-57
  前言  33-35
  材料与方法  35-40
  结果  40-50
  讨论  50-52
  结论  52-53
  参考文献  53-57
综述  57-68
  参考文献  62-68
作者简历及在学期间参与课题和发表论文  68

HBx knockdown对HepG2.2.15细胞HBV复制和线粒体钙通道的影响及其表达谱分析

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