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Al(OH)3和CpG ODN免疫佐剂对丙型肝炎病毒多表位抗原PCX3疫苗免疫效果影响的研究

作　者: 祁淑红
导　师: 任大明
学　校: 复旦大学
专　业: 遗传学
关键词: HCV HCV蛋白疫苗 Al（OH）3佐剂 CpG ODN佐剂 体液免疫 细胞免疫
分类号: R392
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


丙型肝炎病毒（HCV）为单股正链RNA病毒,其基因组编码约3010～3033aa的蛋白前体,从N-端起依次为核心蛋白（C）、包膜蛋白（E）、非结构蛋白NS1-NS5B。HCV具有高度的变异性,能够迅速突变逃逸宿主的免疫系统。因此,给疫苗的研究带来许多的困难。近年来的研究提示理想的HCV疫苗必须能够诱发高水平、广谱而特异的体液免疫应答和细胞免疫应答。针对HCV的高度变异性及免疫特点,在HCV基因产物中优选了5个具有良好免疫原性的高度保守B/T细胞表位,组合成一个多表位抗原基因pcx,这些表位分别来自核心蛋白（1～16aa,132～141aa）,E1（126～135aa）,NS3（139～147aa）及NS5B（768～775aa）,以及破伤风毒素的T细胞表位用以增强T细胞免疫。pcx基因经过串联重复之后,构建成多表位抗原基因pcx3,与6×His-tag融合后,在E.coli宿主中获得高效表达,并通过Ni2+-NTA-agarose纯化。以HCV蛋白疫苗PCX3为抗原,分别加入Al（OH）3佐剂,CpG ODN佐剂,以及两种佐剂联合作用的复合佐剂,对雄性六周龄BALB/c小鼠进行常规免疫。Al（OH）3和CpG ODN复合佐剂与PCX3抗原联合作用组与其他免疫组相比,在ELISA检测小鼠血清中特异性IgG和IgM抗体实验中,该组小鼠产生的特异性IgG（1×106）和IgM（1×105）抗体滴度最高,持续时间最长;在非放射性细胞毒活性检测试剂盒检测NK细胞的自然杀伤效应（CTL）实验中,该组小鼠诱发的CTL杀伤效应（40.91%）,显著高于其他免疫组（P＜0.05）;流式细胞仪对小鼠淋巴细胞亚群进行分型分析发现,从第2周开始,该组小鼠体内CD4+/CD8+细胞比值（3.26）显著高于PCX3抗原单独作用组（P＜0.05）。结果表明,Al（OH）3和CpG ODN复合佐剂,可以从体液免疫和细胞免疫两方面对HCV蛋白疫苗PCX3的免疫效果进行增强,并且具有协同效应。

全文目录


摘要  5-6
ABSTRACT  6-7
一 前言(INTRODUCTION)  7-33
  1.1 丙型肝炎以及丙型肝炎疫苗  7-24
    1.1.1 丙型肝炎简介  7
    1.1.2 丙型肝炎病毒的分子生物学  7-8
    1.1.3 丙型肝炎病毒的基因组结构及功能  8-12
    1.1.4 HCV复制  12-13
    1.1.5 病毒颗粒的生活周期  13-14
    1.1.6 HCV的治疗  14-17
    1.1.7 丙型肝炎疫苗的研究进展  17-24
  1.2 佐剂  24-31
    1.2.1 免疫佐剂的功能  25
    1.2.2 免疫佐剂作用机理  25
    1.2.3 免疫佐剂的分类  25
    1.2.4 几种常用佐剂  25-30
    1.2.5 佐剂的研究进展  30-31
  1.3 总结与展望  31-33
二 材料与方法(MATERIALS AND METHODS)  33-43
  2.1 材料  33-37
    2.1.1 菌株和质粒  33
    2.1.2 试剂  33
    2.1.3 主要仪器  33-34
    2.1.4 常用储存液以及缓冲液  34-37
  2.2 方法  37-43
    2.2.1 目的基因的表达  37
    2.2.2 PCX3蛋白的表达  37-38
    2.2.4 纯化蛋白的复性  38
    2.2.5 纯化蛋白的定量  38-39
    2.2.6 Al(OH)_3佐剂的配制  39
    2.2.7 CpG ODN佐剂的配制  39
    2.2.8 免疫BALB/c小鼠  39-40
    2.2.9 小鼠血清特异抗体的检测  40
    2.2.10 淋巴细胞亚群分析  40-41
    2.2.11 细胞毒T淋巴细胞效应(CTL效应)  41-42
    2.2.12 实验小鼠安全性评价  42
    2.2.13 统计学分析  42-43
三 结果分析(RESULTS AND ANALYSIS)  43-50
  3.1 PCX3目的蛋白的表达和纯化  43-44
    3.1.1 目的基因的小量表达  43
    3.1.2 PCX3目的蛋白的大量表达和纯化  43-44
    3.1.3 蛋白质浓度的测定  44
  3.2 不同佐剂诱导的特异性体液免疫应答  44-46
    3.2.1 检测特异性抗PCX3 IgG抗体  44-45
    3.2.2 检测特异性抗PCX3 IgM小鼠抗体  45-46
  3.3 淋巴细胞亚群分析  46-47
  3.4 细胞毒T淋巴细胞效应(CTL效应)  47-48
  3.5 安全性评价  48-50
四 讨论(DISCUSSION)  50-56
  4.1 HCV蛋白疫苗设计方案  50-51
  4.2 PCX3蛋白纯化,复性和定量  51-52
  4.3 小鼠免疫的疫苗配制  52-53
  4.4 特异性抗体检测  53-54
  4.5 流式细胞仪分析小鼠全血的淋巴细胞亚群  54
  4.6 细胞毒T淋巴细胞效应  54-55
  4.7 AL(OH)_3佐剂与CPG ODN佐剂的协同效应  55-56
参考文献(REFERENCES)  56-66
致谢  66-67

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 医学免疫学
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