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IKK2dn转染未成熟树突状细胞诱导产生的CD4~+CD25~-T细胞的筛选及功能鉴定

作　者: 张东兴
导　师: 欧阳骏
学　校: 苏州大学
专　业: 泌尿外科学
关键词: 树突状细胞 IKK2dn 混合淋巴细胞反应 调节性T细胞 免疫耐受
分类号: R392
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


目的:建立一种稳定的大鼠骨髓源性树突状细胞(dendritic cells, DC)的体外培养方法,用IKK2dn转染未成熟树突状细胞(immature dendritic cells, imDC)并负载供者抗原,用其与受者T细胞进行体外混合淋巴细胞反应(mixed lymphocyte reaction, MLR)诱导产生调节性T细胞(T-regulatory cells, Treg),从Treg中筛选出高活性高纯度的CD4~+CD25~-T细胞,并对CD4~+CD25~-T细胞免疫功能进行初步鉴定,为Treg在诱导移植免疫耐受研究领域奠定基础。方法:本实验分为两部分进行:第一部分,从Lewis大鼠双侧股骨及胫骨中无菌取出骨髓细胞,采用Tris-NH4Cl裂解其红细胞,密度梯度离心法去除大部分的粒细胞、血小板以及其前体,粘附法逐步洗脱残余的粒细胞,获得骨髓单个核细胞(Mononuclear cell, MNC)。用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor, GM-CSF)和白介素-4 (interleukin-4, IL-4)培养骨髓单个核细胞,分别收集培养第5、7、11、13天的细胞。用光镜及透射电镜观察细胞形态,流式细胞术(flow cytometer, FCM)检测细胞表型,MLR鉴定其功能。第二部分,IKK2dn转染imDC并负载供者BN大鼠抗原,将其与受者Lewis大鼠T细胞进行体外MLR诱导产生Treg,用免疫磁珠(magnetic active cell sorting, MACS)双阴性筛选法筛选出CD4~+CD25~-T细胞,用光镜及透射电镜观察细胞形态,FCM检测细胞纯度,实验分为两组:①对照组:丝裂霉素C灭活的BN大鼠脾细胞刺激Lewis大鼠T细胞进行MLR;②实验组:丝裂霉素C灭活的BN大鼠脾细胞刺激Lewis大鼠T细胞进行MLR,同时加入CD4~+CD25~-T细胞。用MTT法检测CD4~+CD25~-T细胞对MLR中Lewis大鼠T细胞的免疫作用。结果:1.每只大鼠双侧股骨及胫骨可获得(3.5±0.75)×10 7个单个核细胞,细胞活力检测>95%。培养的imDC和mDC通过光镜及透射电镜观察均符合其结构特征,流式细胞仪检测细胞表型:培养第7天的DC其CD80、CD86、MHC-II的表达阳性率分别约为(39.35±1.58)%、(31.22±1.28)%和(33.34±5.55)%。培养第11天的DC其CD80、CD86、MHC-II的表达阳性率分别约为(72.12±5.15)%、(59.44±3.02)%和(61.35±1.56)%,第11天的表型检测结果明显高于第7天(P<0.05)。第7天与第11天DC的MLR吸光度值比较差异有统计学意义(P<0.05)。2.将转染IKK2dn并负载供者BN大鼠抗原的受者Lewis大鼠imDC与受者Lewis大鼠T淋巴细胞进行MLR诱导产生的Treg,经MACS筛选可以获得活性及纯度均在95%以上的CD4~+CD25~-T细胞,MTT法检测MLR中受者T细胞的增殖反应的吸光光度值:①对照组为0.259±0.057。②实验组:0.064±0.016。两组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论:1.我们建立了一种稳定的大鼠骨髓源性DC的体外培养方法,用GM-CSF和IL-4培养大鼠骨髓源性单个核细胞5~7天,可以获得足够数量和纯度的imDC,适宜移植免疫耐受领域的研究。2.转染IKK2dn并负载抗原的imDC诱导产生的Treg,经MACS筛选可以获得高活性高纯度的CD4~+CD25~-T细胞。3. CD4~+CD25~-T细胞在MLR中对反应性T细胞具有免疫抑制作用。4. CD4~+CD25~-T细胞的分离及功能鉴定为体内、外实验研究移植免疫耐受提供实验基础和理论依据,并可能为进一步地建立临床移植免疫耐受奠定了基础。

全文目录


摘要  4-6
Abstract  6-10
引言  10-14
  参考文献  12-14
第一部分 DC 的分离、培养及功能鉴定  14-32
  材料与方法  14-19
  结果  19-25
  讨论  25-29
  参考文献  29-32
第二部分 CD4~＋CD25~-T 细胞的筛选及功能鉴定  32-46
  材料与方法  32-37
  结果  37-39
  讨论  39-42
  参考文献  42-46
结论  46-47
综述  47-60
  参考文献  55-60
中英文缩略词表  60-61
攻读学位期间发表的论文  61-62
致谢  62-63

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 医学免疫学
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