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组织工程脂肪移植预防硬膜外瘢痕形成

作　者: 陈亚楠
导　师: 李正维
学　校: 大连医科大学
专　业: 外科学
关键词: 前脂肪细胞纤维蛋白凝胶组织工程细胞培养硬膜外瘢痕
分类号: R687.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

目的:前脂肪细胞能定向分化为成熟脂肪细胞,而纤维蛋白凝胶与多种细胞都具有良好的生物相容性。体外实验证明:前脂肪细胞可在纤维蛋白凝胶中有效黏附、增殖并诱导分化为成熟的脂肪细胞。因此本次实验将前脂肪细胞与纤维蛋白凝胶复合物植入体内,探索前脂肪细胞在体内增殖、分化的可行性。从而为组织工程脂肪移植预防硬膜外瘢痕形成提供理论基础。本实验研究的目的就是:体外分离培养大鼠的前脂肪细胞并与纤维蛋白凝胶复合,回植入大鼠椎板缺损区,探索其复合体植入大鼠体内预防硬膜外瘢痕形成的效果。方法:(1)将80只大鼠随机分成4组。A组为前脂肪细胞-纤维蛋白凝胶支架复合物植入组。B组为自体脂肪颗粒与纤维蛋白凝胶混合物植入组。C组单纯自体脂肪颗粒植入组。D组为空白对照。(2)大鼠前脂肪细胞的培养:将A组大鼠分别于10%水合氯醛腹腔注射麻醉(0.35 mg/100g)后。无菌取出附睾部腹股沟部脂肪组织。剪去脂肪组织中较大的血管和结缔组织,用眼科剪将附睾部和腹股沟部混和脂肪组织剪成1mm3左右的碎块。加入胶原酶消化液,37℃消化1小时,每五分钟振荡一次。通过孔径为100um和25um的尼龙筛,收取过滤液离心10分钟(600g)。弃去上清液,加入红细胞裂解液,吹打均匀,室温静置10分钟。再次离心5分种,弃去上清液,加入无血清培养液,吹打均匀,重复一次即得到前脂肪细胞。将前脂肪细胞消化传代至底面积为25cm2培养瓶中,加入完全培养液(DMEM+10%FBS+100U/ml青、链霉素),在37℃细胞培养箱(5%CO2)中培养,每两天更换培养液一次,培养细胞至实验所需数量。(3)前脂肪细胞与纤维蛋白凝胶混合物的制备。先将培养瓶中生长状况良好处于对数生长期内的前脂肪细胞用0.25%的胰酶消化、离心,再用细胞记数板显微镜下计数,然后用含10%胎牛血清及诱导分化剂的DMEM培养液制作成密度为1×10~5/ml的单细胞悬液备用。将纤维蛋白原加入含血清DMEM培养液充分溶解,配制成为75mg/ml纤维蛋白原溶液,凝血酶用含40mmol/L氯化钙的溶解液溶解,使其最后凝血酶浓度为100u/ml。向24孔培养板每孔滴入前脂肪细胞悬液100ul,加入预温至37℃的纤维蛋白原200ul,然后加入凝血酶溶液100u1,震荡混匀后将培养板放入37℃培养箱内数分钟即见凝胶形成。每孔再加入培养液,置于培养箱内,待植入A组大鼠椎板缺损区。(4)组织工程脂肪的体内实验.1)动物椎板缺损模型制备及组织工程脂肪的移植:各组的SD大鼠均以10%水合氯醛腹腔麻醉后,无菌条件下手术。取背部正中纵行切口,切除L1-L3棘突及全椎板,造成0.3cmx1.0cm椎板缺损,切除黄韧带,清除硬膜外脂肪,保留完整硬膜。制成椎板缺损模型。彻底止血后,清除所有显微镜下所能见到的软组织纤维状物及碎骨片,A组植入前脂肪细胞-纤维蛋白凝胶支架复合物,B组植入自体脂肪颗粒与纤维蛋白凝胶混合物,C组植入单纯自体脂肪颗粒,D组为空白对照。植入时以铺满缺损区域为宜,关闭切口后,定期观察椎板缺损区的瘢痕组织情况。2)标本制作、观察项目、检测方法及指标。(1)大体观察:分别在术后4、8、12周各取3只大鼠,在手术显微镜下按原手术入路进行解剖观察。将肉眼看到的硬膜外瘢痕按照改良Rydell-Balazs标准进行粘连程度评分。(2)光镜观察。取材时间点同上,每组每次4只动物。完整取出手术段脊柱,置入10%的硝酸-福尔马林混合液溶液中固定3d,再用50%的甲酸在室温下脱钙,然后标本中段取材,常规脱水与石蜡包埋,5μm的连续切片,每个标本切片2张,其中1张行HE染色,光镜下观察,按改良Nussbaum标准行组织学评分。1张行VG染色,观察瘢痕中胶原的性质及其分布。(3)电镜观察。8周时在显微镜下切取各组大体标本之硬膜外瘢痕,约1mm×1.5mm×2mm大小,经戊二醛固定后制作超薄切片,用透射电镜下观察其超微结构。结果:从大鼠身上成功的分离并培养出前脂肪细胞,在体外大量扩增,光学显微镜下观察可见前脂肪细胞在纤维蛋白凝胶上具有良好的黏附,生长能力。分离纯化的大鼠前脂肪细胞与纤维蛋白凝胶复合植入大鼠椎板缺损区,4周时硬膜后可见较多存活脂肪组织,硬膜外无粘连,8、12周时硬膜后仍可见存活脂肪组织,硬膜外粘连轻。A组硬膜外瘢痕粘连较其他组少,B组次之,D组最大。结论:纤维蛋白凝胶与前脂肪细胞有良好的生物相容性,可作为前脂肪细胞的载体,是组织工程脂肪可行的支架材料。自体前脂肪细胞与纤维蛋白凝胶制成的混合物植入椎板缺损区,可预防椎板缺损区硬膜外腔瘢痕的形成,作为一种新方法用于预防椎板切除术后硬膜外腔瘢痕形成与粘连。

全文目录

一、摘要  6-12
  （一）中文摘要  6-9
  （二）英文摘要  9-12
二、文献综述  12-23
  （一）综述  12-19
  （二）参考文献  19-23
三、正文  23-38
  （一）前言  23-25
  （二）材料和方法  25-27
  （三）结果  27-29
  （四）讨论  29-33
  （五）结论  33-36
  （六）参考文献  36-38
四、致谢  38

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