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N-乙酰半胱氨酸对甲基苯丙胺神经损伤保护作用的研究

作　者: 宋健文
导　师: 王慧君
学　校: 南方医科大学
专　业: 法医学
关键词: 甲基苯丙胺神经损伤神经毒性氧化应激二甲基精氨酸二甲基氨基水解酶不对称性二甲基精氨酸一氧化氮合酶一氧化氮
分类号: D919
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

研究背景甲基苯丙胺(Methamphetamine,METH,MA)属于苯丙胺类神经兴奋剂(Amphetamine-Typed Stimulant,ATS),其盐酸盐为透明的结晶体,状如冰,俗称“冰毒”。METH具有多种药理及毒理学特性,最初是作为减肥药、抗疲劳剂使用,随后发现其具有精神依赖性,因此被列入联合国精神药品公约管制的精神活性药物,然而近年世界范围内对此药的滥用呈上升趋势,国内的滥用情况也十分严峻,所以对METH毒性机制的研究成为世界面临的重大课题和研究热点。动物实验和临床资料表明,METH滥用可导致显著的精神和行为改变,如刻板运动、亢奋、易激惹等。研究显示METH对心、肝、肾等组织器官均有毒性作用,但更主要的是对中枢神经系统的毒性。METH可导致大脑纹状体、海马、皮质等多部位损伤,包括神经细胞凋亡、多巴胺(DA)耗竭、多巴胺转运体(DAT)减少和酪氨酸羟化酶活性(TH)下降。目前认为,过量多巴胺的氧化作用、谷氨酸介导的兴奋性毒性作用、线粒体功能紊乱以及大脑神经元凋亡是METH导致中枢神经损伤的可能机制,然而,当前国内外的研究结果尚不足以完全阐明METH确切的神经毒性机制。目的大量研究支持氧化应激是METH神经毒性的重要机制。我们前一阶段研究结果显示METH引起大鼠纹状体NOS活性升高,NO含量提高,产生大量的活性氧(ROS)和活性氮(RNS),这些物质可引起神经元SOD含量下降,导致中枢神经系统损伤,而nNOS的抑制剂7-NI能减轻神经毒性。研究表明不对称性二甲基精氨酸(ADMA)是一氧化氮合酶(NOS)的内源性竞争性抑制剂,可抑制NO合成,而绝大部分的ADMA为二甲基精氨酸二甲基氨基水解酶(DDAH)降解。我们以往的研究发现METH中毒大鼠纹状体区DDAH 1表达升高,此外各种研究表明ADMA与氧化应激密切相关。然而METH是否通过干扰DDAH/ADMA系统影响NO的合成而产生神经毒性,目前尚未见有相关报道。N—乙酰半胱氨酸(NAC)是一种强有力的抗氧化剂,其自身具有清除自由基功能,可促进谷胱甘肽(GSH)的合成,增强组织抗氧化能力。本研究假设METH诱导纹状体氧化应激,通过DDAH/ADMA系统介导神经毒性损伤作用。为达此目的,建立METH中毒大鼠模型,运用病理学技术、分子生物学、神经化学等方法探讨METH的神经毒性,并且在此基础上检测NO上游调控系统DDAH的蛋白表达、ADMA含量及NOS活性等指标的变化,此外还对NO下游作用产物过氧亚硝酸盐(ONOO~-)进行定量以及通过TUNEL方法检测大脑神经元的凋亡与氧化应激的关系,最后研究抗氧化剂NAC对甲基苯丙胺神经毒性的影响及其与DDAH/ADMA系统的关系,从一个新的角度探讨METH神经毒性机制。方法1 METH中毒模型的建立和毒性观察Wistar雄性大鼠,共40只,体重180g～220g,12 h光暗交替循环,保持自由饮水及进食。将动物随机分为4组,NS组腹腔注射生理盐水,每天2次(8:00AM,6:00 PM),每次1mL,连续注射6天;METH组前两天注射生理盐水,第3～6天,腹腔注射METH(15mg/kg体重),注射方法同NS组;NAC组注射方法同NS组,用NAC替代生理盐水,NAC的注射剂量为150mg/kg体重;NAC+METH组前两天注射NAC,第3～6天,在METH注射前30min先腹腔注射NAC(150mg/kg体重),METH的注射方法同METH组。最后一次用药72h后,处死大鼠取脑和其它器官。在实验过程中观察动物的体重、体温和行为学改变;利用HE染色观察动物脑、心、肝、肺、肾组织病理学改变;高效液相色谱方法(HPLC)检测纹状体区DA及DOPAC含量的改变;利用ROS检测试剂盒检测纹状体区ROS含量的变化。2 NAC对METH神经损伤的保护作用涉及DDAH/ADMA系统利用荧光检测方法,用ONOO~-氧化应激试剂盒检测纹状体ONOO~-的变化;利用TUNEL方法观察纹状体神经元的凋亡情况;Western Blotting检测DDAH 1的蛋白表达;HPLC检测ADMA水平的改变;酶化学方法检测NOS活性的变化。结果1.腹腔注射METH后,大鼠的体重显著降低(P=0.000),体温显著性升高(P=0.000),并且出现显著的行为学改变(P=0.000),主要表现为活动增多、刻板样运动活跃等。镜下部分大鼠肝细胞水肿,肺广泛充血、炎细胞浸润,神经元水肿,出现明显的噬神经现象。纹状体的ROS水平显著性升高(P=0.000),DA及DOPAC水平显著降低(P=0.000;P=0.003),其差异有统计学意义。而使用NAC预处理的NAC+METH组与METH组相比,行为评分及ROS水平显著性降低(P=0.000;P=0.000),而DA及DOPAC含量显著性回升(P=0.000;P=0.040)。2.与NS组相比,METH组纹状体区DDAH 1蛋白表达水平明显升高,ADMA含量显著性降低(P=0.000),NOS活性、ONOO~-水平及神经元凋亡数均显著性增加(P=0.000,P=0.000,P=0.000)。而使用NAC预处理的NAC+METH组与METH组相比,纹状体区DDAH 1蛋白表达水平呈一定程度的回落,ADMA含量显著性回升(P=0.006),NOS活性、ONOO~-水平及神经元凋亡数均显著性降低(P=0.000,P=0.003,P=0.000)。且ADMA和ONOO~-含量之间存在负相关关系,ONOO~-含量与大脑神经元凋亡数呈正相关关系。结论1.METH诱导纹状体区组织内ROS的产生和清除失衡,产生显著的神经毒性,引起大鼠神经行为学改变,致使大脑神经元损伤,导致DA和DOPAC含量下降及ROS水平的升高,而抗氧化剂NAC可减轻以上毒性改变。2.METH诱导纹状体区的NO上游调控DDAH/ADMA系统及下游产物的改变。主要表现为大鼠脑组织纹状体区DDAH 1表达水平的升高,ADMA水平的降低,NOS活性、ONOO~-水平及神经元凋亡数的增加,且ADMA和ONOO~-水平之间存在负相关关系,但是抗氧化剂NAC可一定程度逆转以上改变,发挥神经保护作用。3.由此可见氧化应激是METH神经毒性的重要机制,而DDAH/ADMA系统可能是一个崭新的神经活性调控机制,在METH神经损伤中发挥作用。

全文目录

摘要  3-7
ABSTRACT  7-14
前言  14-28
  1 甲基苯丙胺的来源及危害  14-15
  2 甲基苯丙胺引起的毒性作用  15-16
  3 甲基苯丙胺的神经毒性机制  16-18
  4 N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine, NAC)  18-19
  5 DDAH/ADMA系统在中枢神经系统中的作用机制  19-21
  参考文献  21-28
第一部分甲基苯丙胺中毒动物模型的建立和毒性观察  28-50
  第一节甲基苯丙胺中毒动物模型的建立和基本毒性观察  28-35
    一甲基苯丙胺中毒动物模型的建立  28
    二甲基苯丙胺对大鼠的基本毒性的研究  28-29
    三结果  29-33
    四讨论  33-35
  第二节 N-乙酰半胱氨酸对甲基苯丙胺中毒大鼠神经毒性的影响  35-46
    一材料和方法  35-38
    二结果  38-44
    三讨论  44-46
  参考文献  46-50
第二部分 N-乙酰半胱氨酸对甲基苯丙胺神经损伤的保护作用:涉及DDAH/ADMA系统  50-73
  一材料与方法  51-56
  二、结果  56-64
  三、讨论  64-68
  参考文献  68-73
全文小结  73-74
附录  74-76
英文缩略语对照表  76-77
在读期间发表文章  77-78
致谢  78-81
研究生毕业论文统计学审稿证明  81

N-乙酰半胱氨酸对甲基苯丙胺神经损伤保护作用的研究

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