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抑癌基因PTEN抑制人气道平滑肌细胞的迁移

作　者: 钟浩海
导　师: 罗雅玲
学　校: 南方医科大学
专　业: 呼吸内科学
关键词: PTEN 气道平滑肌细胞 细胞迁移 细胞骨架
分类号: R562.25
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


研究背景及目的支气管哮喘（Bronchial asthma,asthma）是一种以气道重塑、气道炎症、气道高反应性为表现的气道慢性炎症性疾病,许多哮喘患者的气管中除有炎性细胞浸润外,还存在不同程度的气管壁结构改变,包括主要有上皮的脱落和增生、杯状细胞和腺体增生、上皮下胶原和细胞外基质沉积、平滑肌肥大和增殖、血管形成、气道软骨减少,即气道重塑（Airway remodeling）。炎症介质及炎症细胞对气管反复损伤和机体对损伤性刺激的修复性反应所形成的气管新组织结构,而气道平滑肌细胞（Airway smooth muscle cells,ASMCs）作为气道中数目和体积均为最大的细胞,在哮喘气道重塑中发挥重要的作用,被认为是哮喘气道重塑的关键细胞。ASMCs的收缩、增殖、肥大、分泌细胞外基质蛋白等促进气道重塑的发生发展,并进一步加重气道高反应性（Airway Hyperreactivity,AHR）。近年来国内外的大量研究发现,ASMCs也具有迁移的功能,这种迁移与动脉粥样硬化时血管平滑肌细胞（Vascular smooth muscle cells,VSMCs）的迁移相类似,因此我们推理:哮喘时ASMCs在细胞外基质和各种细胞因子、炎症介质和生长因子的联合作用下,ASMCs向气道内膜定向移动并发生增殖,导致气道壁的增厚和狭窄,虽然目前还缺乏ASMCs向气道内膜直接迁移的证据,但有研究发现,在哮喘患者气道活检组织标本中,气道固有层内发现的肌纤维母细胞在显微结构、形态学和位置方面都与ASMCs极其相似,提示肌纤维母细胞可能是ASMCs迁移并转化而来,ASMCs的迁移的研究是近来的热点之一,但对于ASMCs迁移的机制目前还不十分清楚。第10号染色体缺失的与张力蛋白同源的磷酸酶基因（Phophatase and tensinhomolog deleted on chromosone 10,PTEN）是至今发现的第一个具有双特异性磷酸酶活性的抑癌基因,对细胞的生长、增殖、分化、凋亡、迁移和血管生长等许多生物学行为有重要影响,该基因的突变、失活与多种肿瘤的发生、发展密切相关。2003年Youn-Geun Kwak及同事首次报道了PTEN参与支气管哮喘气道炎症和气道高反应性的发生,PTEN蛋白的表达和活性在卵清蛋白（OVA）-诱导的哮喘豚鼠模型中降低,而支气管内应用携带PTEN cDNA的腺病毒（Ad-PTEN）转染后,哮喘鼠BAL液中IL-4、IL-5和嗜酸细胞阳离子蛋白（ECP）水平下调,气道炎症减轻。大量研究已经证实抑癌基因PTEN可以通过对磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）、细胞外信号调节激酶（ERK）及黏着斑激酶（FAK）等信号通路的抑制从而抑制肿瘤细胞、心肌和血管平滑肌等细胞的增殖、迁移,促进细胞的凋亡。而以上这些通路同时也是介导人ASMCs增殖、迁移等的主要信号传导通路,在人ASMCs中PTEN对这些通路是否也有类似地影响,目前我们尚不清楚。因此,本实验主要对以下两个方面进行研究:一)构建携带野生型质粒PTEN的腺病毒载体。二)初步探讨PTEN在ASMCs迁移中的作用。材料与方法1、经患者同意,取南方医院胸外科同期做肺叶切除术患者的正常肺叶、段支气管标本。2、组织块贴壁法培养人支气管平滑肌细胞（Airway smooth muscle cells,ASMCs）,光镜下观察和α-actin细胞免疫组化进行ASMCs鉴定。3、构建携带野生型质粒PTEN的腺病毒载体,PCR、western blot等鉴定载体构建的成功。3、使用Transwell趋化小室检测ASMCs的跨膜迁移能力的变化。4、利用细胞划痕实验再次检测ASMCs迁移能力的变化。5、FITC标记的鬼笔环肽标记F-肌动蛋白骨架,激光共聚焦扫描显微镜观察ASMCs细胞骨架的变化。6、Western blot检测各组（Ad-PTEN组、Ad-GFP组、DMEM空白对照组）信号通路中磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）、细胞外信号调节激酶（ERK）及黏着斑激酶（FAK）磷酸化水平的改变,以反应相应信号通路在细胞迁移中的作用。7、采用SPSS13.0统计软件进行结果分析,统计数据用均数±标准差（（?）±S）表示,各处理组间比较用析因分析,P＜0.05为差异有统计学意义。结果1、ASMCs的形态及免疫组化鉴定:倒置显微镜下单个ASMCs呈长梭形,贴壁生长至融合后,细胞呈现出特征的“峰、谷”状形态。细胞免疫组化平滑肌细胞表型标志物α-actin鉴定,光镜下可见细胞浆中较多棕黄色颗粒为染色阳性细胞。2、重组穿梭载体质粒、重组腺病毒质粒经过PCR酶切鉴定,得到我们所需的一条1.3 kb小片断及酶切条带,腺病毒经过包装、扩增及滴度测定,最终用PTEN的原始质粒特异性引物进行PCR,从病毒液中扩增出目的片段,大小为559 bp,因此证实腺病毒构建成功。3、体外细胞划痕实验可见在0h时,Ad-PTEN、Ad-GFP与DMEM三组之间划痕面积（细胞数）相差不大,三组作用于ASMC 48 h后,加入刺激因子PDGF-BB组:Ad-PTEN（44.40±9.15）细胞数明显较Ad-GFP（215.20±27.02）与DMEM（192.80±19.89）明星减少,而未加入刺激因子PDGF-BB组:Ad-PTEN（38.40±7.73）、Ad-GFP（94.40±12.05）、DMEM（83.20±7.59）。在Ad-PTEN组细胞迁移数目的减少与腺病毒本身无关,而是目的基因PTEN起到抑制细胞迁移的作用（P＜0.00）,因为空病毒对照组Ad-GFP与无病毒对照组DMEM间细胞迁移的面积相差不大（P＞0.163）。同时经过PDGF-BB处理的三组ASMCs迁移的细胞数目较未加PDGF-BB处理明显增加。4、Transwell趋化小室检测法证实腺病毒Ad-PTEN明显能抑制ASMCs的迁移活动,Ad-PTEN作用于ASMCs时迁移细胞数目是（206.40±20.48）,而Ad-GFP组与DMEM空白对照组细胞迁移的数目分别是（658.00±46.58）、（658.80±61.81）,而加入刺激因子PDGF-BB后各组的细胞迁移数目分别是:Ad-PTEN（610.40±26.20）、Ad-GFP（1506.60±92.03）、DMEM（1511.20±71.66）,这较不加刺激因子组有较大的促进迁移作用,无论是否存在刺激因子,Ad-PTEN较Ad-GFP及DMEM相比,有明显的差异,差异有统计学意义（P＜0.00）。说明PTEN能抑制ASMCs的迁移活动,同时再次验证PDGF-BB是一个促迁移因子。5、激光共聚焦观察细胞骨架:Ad-GFP、DMEM空白对照组细胞有少量短而细的应力纤维,很少丝状伪足形成,而Ad-PTEN可见细胞细胞轮廓变细,伪足及应力纤维明显变少。Ad-PTEN、Ad-GFP及DMEM三组加入刺激因子PDGF-BB刺激60min后,细胞即发生伸展,应力纤维形成增多。6、Ad-PTEN、Ad-GFP及DMEM处理后:（1）、磷酸化Akt（p-Akt）/总的Akt灰度值比分别为:0.059±0.001、0.503±0.001、0.502±0.001,三组间有显著性差异（P＜0.00）,有统计学意义,说明PTEN可能通过抑制Akt通路抑制ASMCs的迁移,Ad-PTEN组p-Akt表达水平显著减少,而两对照组间无显著性差异（P＞0.244）。而加入刺激因子PDGF-BB后,Ad-PTEN、Ad-GFP及DMEM三组磷酸化Akt（p-Akt）/总的Akt灰度值比分别为:0.098±0.001、0.701±0.001、0.700±0.001,与未加刺激组同理,亦有统计学意义。（2）、磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)/总的ERK1/2灰度值比分别为:0.745±0.002、0.743±0.002、0.744±0.002,三组间无显著性差异（P＞0.15）,无统计学意义,PTEN可能不是通过抑制ERK1/2通路而抑制气道平滑肌细胞的迁移。而加入刺激因子PDGF-BB后,Ad-PTEN、Ad-GFP及DMEM三组磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)/总的ERK1/2灰度值比分别为:0.802±0.001、0.803±0.001、0.804±0.002,同理亦无统计学意义（P＞0.071）。（3）、磷酸化FAK（p-FAK）/总的FAK灰度值比分别为:0.099±0.002、0.647±0.001、0.649±0.001,三组间有显著性差异（P＜0.00）,有统计学意义,说明PTEN可能通过抑制FAK通路抑制ASMCs的迁移,Ad-PTEN组p-FAK表达水平显著减少,而两对照组间无显著性差异（P＞0.767）。而加入刺激因子PDGF-BB后,Ad-PTEN、Ad-GFP及DMEM三组磷酸化FAK（p-FAK）/总的FAK灰度值比分别为:0.081±0.040、0.721±0.001、0.725±0.001。与未加刺激组同理,亦有统计学意义（P＜0.00）。结论PTEN能够通过抑制磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）及黏着斑激酶（FAK）等信号通路从而抑制ASMCs的迁移,且PTEN可能通过抑制细胞骨架蛋白的改变来抑制ASMCs的迁移,这提示PTEN对气道重塑起到很重要的抑制作用。

全文目录


摘要  3-8
ABSTRACT  8-13
前言  13-17
实验技术路线  17-18
第一部分 PTEN基因重组腺病毒的构建  18-38
  材料与方法  18-35
    1 试剂与仪器  18-19
    2 方法  19-31
    3 鉴定结果  31-35
  讨论  35-38
第二部分 PTEN腺病毒对气道平滑肌细胞迁移的影响及作用机制的探讨  38-61
  材料与方法  38-50
  结果  50-59
  讨论  59-61
参考文献  61-66
全文总结  66-67
成果  67-68
附录  68-70
致谢  70-72
统计学证明  72

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中图分类: > 医药、卫生 > 内科学 > 呼吸系及胸部疾病 > 气管和支气管疾病 > 支气管疾病 > 支气管哮喘
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