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脂肪来源干细胞参与大鼠软组织创面修复的实验研究

作　者: 南华
导　师: 高建华
学　校: 南方医科大学
专　业: 整形外科学
关键词: 脂肪组织来源干细胞软组织创伤移植 DiI 大鼠
分类号: R641
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

背景由于外伤、肿瘤切除和先天性畸形造成的巨大组织缺损很难单纯依靠机体自身修复来实现。目前的众多临床修复方案都有一定的局限性,例如组织瓣转移修复带来供区的破坏,组织代用品充填易导致异物反应等等。在影响组织缺损修复的众多因素中,参与组织再生的自体局部干细胞来源不足、促愈的细胞因子缺乏及血管化减少是影响组织缺损修复的关键因素。因此,通过有效补充及增强缺损部位干细胞的数量及功能,为促进创伤愈合及大范围软组织缺损修复提供了一种新的治疗策略。迄今为止,干细胞治疗已经应用于多种领域,逐渐成为组织损伤后促进创伤愈合的新型疗法。干细胞是一种非成熟细胞,具有很强的多向分化潜能。理论上,干细胞具有在组织损伤的内环境下,受到多方面因素的刺激,具有定向诱导分化的能力,即实现损伤组织的按需修复与再生的可能,在这方面进行的相关研究在国内外都有一些报道,研究证明干细胞在组织修复上的确产生了作用和影响,因此以干细胞为基础的细胞疗法正成为再生医学研究领域中的热点和前沿。对于间充质干细胞研究较多的是骨髓来源干细胞(Bone mesenchymal stemcells,BMSCs)和脂肪来源干细胞(Adipose-derived stem cells,ADSCs)。BMSCs体内外被证实都具有一定的分化能力,其促进创伤愈合的作用已有诸多报道,但骨髓抽取困难且总量有限,限制了这种细胞的广泛应用。研究证实ADSCs同样具有体外多向分化潜能,如向脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞、肌肉细胞及心肌细胞定向转化,而且具有取材方便、来源广泛、可获取量更大、不易造成供区继发畸形等独特的优势,近年来已成为继BMSCs之后的研究热点。国内外已有研究将ADSCs用于组织工程化构建及某些特定组织损伤修复的细胞疗法中,均获得较好的效果。但是ADSCs在创伤尤其是软组织创面中的促愈作用以及如何实现在体内的迁移和分布上不清楚,目前关于这方面的研究在国内外文献中尚未见专门的报道,另外关于ADSCs通过局部和全身两种移植途径的有效性,哪一种可以作为细胞疗法中更好的移植途径目前也尚无定论,因此对这一课题进行广泛深入的探讨具有深远的意义。目的1.通过对大鼠ADSCs的分离培养,体外诱导培养ADSCs向脂肪、骨、神经方向分化以鉴定其干细胞特性,为后续的体内移植动物实验提供符合要求的ADSCs。2.研究ADSCs对软组织创面是否具有促愈作用,分析比较全身和局部两种移植途径的有效性是否一致。为ADSCs在创伤修复中的应用提供实验基础。3.探讨全身途径移植的ADSCs在创伤诱导下是否具有向创伤部位趋向迁移的特性,为ADSCs在体内的迁移动力机制提供实验依据。方法1、ADSCs分离培养及体外三向诱导分化取SD大鼠腹股沟部脂肪垫,使用酶消化法进行原代培养,观察细胞形态及变化,收集第3代细胞供体外诱导分化用。取生长良好的细胞分别加入成脂、成骨、成神经诱导液培养基,进行体外三向诱导分化,诱导一定的时间后选择特定的细胞标记物抗体和染色方法以鉴定其干细胞特性,包括成脂肪诱导和油红O染色、成骨诱导和Von Kossa染色、成神经诱导和免疫细胞化学荧光Nestin染色及免疫组化MAP-2检测。2、大鼠软组织缺损创面模型制备将大鼠成功麻醉后,在其背部脊柱两侧相距2cm处分别建立1.8cm×1.8cm面积的圆形创面,全层切除皮肤至部分臀肌,形成深度0.5cm的创腔,使初始创腔容积均为1ml。根据实验目的分成两批动物进行相关实验,对每批成模动物进行随机性分组。第一批大鼠共18只,每组6只,主要观察创面愈合情况及创面愈合后组织病理学改变。第二批大鼠共12只,每组6只,主要观察全身移植途径的ADSCs向创伤部位的迁移和分布。3、DiI标记ADSCs及体内移植用荧光染料DiI体外标记大鼠第2～4代的ADSCs,倒置显微镜及荧光显微镜观察细胞存活情况及标记的荧光强度,将标记成功的ADSCs加入DMEM中制备成待移植的细胞混悬液。按实验设计对成模动物均通过左侧创面和尾静脉注入等体积相应的液体。全身细胞组经尾静脉注射细胞混悬液,局部细胞组经左侧创面点状注射细胞混悬液,对照组分别通过不同途径注射DMEM液。术后定期观察记录各组大鼠创面变化和创口愈合情况,测量创口收缩面积、记录创面完全愈合时间,24d、48d后分别获取创面愈合组织,一方面将组织快速冰冻切片后直接置于荧光显微镜下观察标记细胞的行踪,另一方面将组织石蜡包埋后切片并进行HE染色,显微镜下观察组织病理结构。结果大鼠腹股沟脂肪垫分离培养出的ADSCs为贴壁细胞,呈成纤维细胞样形态,体外培养增殖速度快,培养方法简单,容易满足实验对细胞数量的要求。ADSCs体外成脂诱导14d后油红O染色阳性,可见圆形细胞内出现脂肪,细胞增殖稳定;ADSCs体外成骨诱导28d后Von Kossa染色阳性,镜下观察到在集落生长的细胞团中出现矿化结节,细胞生长减慢;ADSCs体外成神经诱导24h后在荧光显微镜下观察到细胞的胞浆表达Nestin,免疫组化染色可见神经元样细胞表达MAP-2,细胞活力良好。证实ADSCs体外诱导分化成功,说明我们培养的大鼠ADSCs具有成脂、成骨、成神经的多向分化潜能,具备干细胞的特性,可用于体内移植的动物实验。DiI标记的大鼠ADSCs置于荧光显微镜下观察,可见细胞膜染呈红色荧光颗粒环状,胞核未染色,标记后的细胞成活率达90%以上。全身细胞组在细胞移植24d时,其标本组织里均可见标记细胞发出的红色荧光,与正常皮肤比较,在创面愈合组织周缘的皮肤和皮下组织深层部位可见较强的荧光分布。细胞移植48d时,创面愈合组织的真皮层和皮下腺样结构组织内荧光有富集,而正常皮肤软组织内只见少量且散在不规则分布的荧光,结果说明全身途径移植的ADSCs在创伤诱导下向创伤部位发生了定向迁移。细胞移植48d时,在全身细胞组大鼠的肺、脾组织中滞留大量且较强的荧光,肝、心、肾组织内亦可见较多细弱荧光,而内脏脂肪中仅见少量荧光,说明大部分的ADSCs可以长期存在并储留于体内毛细血管网丰富的的脏器内。局部细胞组在早期即表现较显著的创面收缩,全身细胞组在术后7d创面收缩才开始加速,这两组较对照组创面的肉芽组织丰富且渗出少,且创面愈合时间均短于对照组,说明两种途径移植的ADSCs都具有促进创面愈合的的作用,局部途径起效快。24d时的组织病理学观察显示局部细胞组创面内形成的腺样结构较多,全身细胞组创面内新生血管形成较明显,对照组创面内的腺样结构及新生血管均较前两者少,说明两种移植途径的ADSCs对创面愈合都有影响,都具有促进血管化的作用。结论1、大鼠ADSCs体外容易分离、培养和扩增,具有干细胞体外多向分化潜能,可以用于体内移植。2、通过全身或局部途径移植的ADSCs对大鼠软组织创面愈合都具有促进作用,局部途径起效快,全身途径起效慢。3、创伤可诱导全身途径移植的大鼠ADSCs向创伤部位发生趋向性迁移,进而参与创面的修复。

全文目录

摘要  3-7
ABSTRACT  7-13
第一章大鼠ADSCs的分离培养及体外三向诱导分化  13-26
  前言  13-14
  材料和方法  14-18
  结果  18-21
  讨论  21-24
  参考文献  24-26
第二章创伤条件下静脉移植的ADSCs在体内的迁移及分布  26-39
  前言  26
  材料和方法  26-28
  结果  28-34
  讨论  34-37
  参考文献  37-39
第三章 ADSCs参与大鼠软组织创伤愈合的作用  39-48
  前言  39
  材料和方法  39-41
  结果  41-46
  讨论  46-48
全文结论  48-49
综述  49-57
中英文缩略词对照表  57-58
攻读学位期间的成果  58-59
致谢  59-60

脂肪来源干细胞参与大鼠软组织创面修复的实验研究

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