学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

致肾盂肾炎大肠杆菌132的比较蛋白质组学研究

作　者: 郭丽茹
导　师: 陈锦英
学　校: 天津医科大学
专　业: 病原生物学
关键词: 致肾盂肾炎大肠杆菌比较蛋白质组学双向凝胶电泳质谱分析致病机制
分类号: R378.21
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 90次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

目的:研究国内分离的致肾盂肾炎大肠杆菌(UPEC)132与国外模型菌株UPECJ96及完成基因组测序的非致病性大肠杆菌K-12 MG1655的蛋白质组的差异。方法:1.对UPEC 132、UPEC J96和E.coli K-12 MG1655进行革兰染色、生化反应、papC PCR检测,鉴定菌株。2.采用比浊法进行细菌计数并绘制各菌株的生长曲线。以此为依据,分别培养至对数生长前期(6h)和后期(12h),离心收获菌体,超声破菌制备双向凝胶电泳蛋白样品,Bradford法测蛋白浓度。3.优化细菌培养和双向凝胶电泳的试验条件:(1)将UPEC132不同培养时间收获的菌体或不同pH梯度下进行的双向凝胶电泳图谱进行比较分析;(2)根据E.coli K-12 MG1655的基因组注释结果,使用pI/Mr Prediction Tool(http:∥www.expasy.org/tools/pi_tool.html)计算,构建其理论双向凝胶电泳图谱,预测其全部蛋白点的分布情况;(3)用pH 4-7的IPG胶条对E.coli K-12MG1655的胞内蛋白样品进行双向凝胶电泳,与其理论双向电泳图谱进行比较,计算分辨率。4.依据优化的条件,分别对三株菌的蛋白样品进行双向凝胶电泳,电泳后经考马斯亮蓝染色,采集图像,使用PD Quest7.0软件对图像进行配比分析。以UPEC 132为核心,选取其特异的及上调表达(表达量差异2倍以上)的蛋白点进行凝胶内胰蛋白酶消化萃取和MALDI-TOF-MS质谱分析。结果:1.UPEC132、UPEC J96以及E.coli K.12 MG1655菌株的鉴定1)三株菌均为革兰阴性杆菌,生化反应符合大肠杆菌。2)papC PCR结果显示:UPEC132和J96均出现预期328bp的阳性扩增带,而E.coli K-12 MG1655没有显示此扩增带,可确定前二者为UPEC菌株。2.三株菌生长曲线相似,经过短暂的迟缓期后进入对数生长期(2-12h)。3.三株菌培养6h收获菌体制备胞内蛋白电泳样品,其蛋白浓度分别为:10.63mg/ml、11.93mg/ml以及11.55mg/ml,培养12h制备的胞内蛋白样品其蛋白浓度分别为11.06mg/ml、12.84mg/ml及12.52mg/ml,结果符合要求。4.双向凝胶电泳试验条件的优化分析1)UPEC132培养6h和12h双向凝胶电泳图谱分布相似,经PD Quest软件分析,前者分辨出472个蛋白点,后者为513个蛋白点,后者蛋白点较前者增加了8.69%。2)UPEC132经pH 3-10的IPG胶条分离获得的双向电泳图谱中蛋白点集中于pH 4-7区间,碱性区域蛋白点稀疏;而用pH 4-7的IPG胶条分离的双向电泳图谱中蛋白点分布均匀,分辨率较好。经软件分析表明,二者蛋白点数分别为268和513,后者分离效果明显优于前者。3)E.coli K-12 MG1655全菌蛋白的理论双向凝胶电泳图谱显示:62.9%的理论蛋白点都集中于pH 4-7之间,27.1%的理论蛋白点分命于pH 8-10之间,只有5.3%的理论蛋白点位于pH 7-8之间。4)使用pH 4-7的IPG胶条分离获得E.coli K-12 MG1655胞内蛋白的双向凝胶电泳图谱,与上述理论图谱相比较已有13.2%(356个)的蛋白点显现。据报道,在当前试验条件下双向凝胶电泳分辨率尚不超过理论值的10%,故本试验的分辨率较为理想。5.双向凝胶电泳结果显示:UPEC132平均识别466±11个蛋白点,J96平均识别382±12个蛋白点,E.coli K-12 MG1655平均识别338±15个蛋白点。三株菌共有的蛋白点为298个(59.7%),UPEC132和E.coli K-12 MG1655共有的蛋白点为33个(6.6%),UPEC132和J96共有的蛋白点为56个(11.2%);UPEC132特异的蛋白点为89个(17.8%),J96特异的蛋白点为22个(4.4%),MG1655特异的蛋白点只有1个(0.2%)。6.经MALDI-TOF-MS分析,22个差异蛋白点得到鉴定,其中15个为UPEC132特异或明显上调表达的蛋白点,7个为UPEC132与J96均上调表达的蛋白点,涉及毒力因子、物质代谢转运、蛋白合成调节、生物氧化及未知功能等。结论:本研究获得了UPEC132、UPEC J96以及E.coli K-12 MG1655胞内蛋白的双向凝胶电泳图谱,通过对三者之间蛋白表达的差异分析,发现了UPEC菌株与非致病性大肠杆菌间的蛋白质组有差异,UPEC132与J96蛋白质组间也有显著不同,表明UPEC菌株存在多态性和国内外菌株的差异,为致肾盂肾炎大肠杆菌的致病机制等深入研究奠定了基础。

致肾盂肾炎大肠杆菌132的比较蛋白质组学研究

内容摘要

全文目录

相似论文