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4℃冷藏血小板生物学性质的实验研究

作　者: 张斌
导　师: 范华骅
学　校: 复旦大学
专　业: 临床检验诊断学
关键词: 血小板 4℃保存 保存液 保护剂 GPIbα 吞噬 THP-1细胞 回收率 地塞米松
分类号: R318.52
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


研究目的:本研究通过体外质量评价指标、THP-1细胞吞噬试验和动物体内实验比较4℃冷藏血小板与22℃室温保存血小板的生物学性质的差异,并对血小板回输体内后被吞噬清除的分子机制进行了探讨。同时还研究了几种低温保护剂对冷藏血小板的影响。材料与方法:(1)取单采血小板样品,均分为两份,分别在4℃和22℃条件下保存。在0d和5d时检测体外质量评价指标血小板计数、平均血小板体积、PH值、血小板聚集率、低渗休克率等,观察两种保存条件下的变化差异。(2)在1d、3d、5d、7d、10d检测GPIbα平均荧光强度(MFI)和P-选择素表达百分率(%),观察变化趋势和差异。(3)取单采血小板样品,均分为两份,分别在4℃和22℃条件下保存,第2d或5d时检测THP-1细胞对其的吞噬率以及表面糖蛋白分子GPIbα、P-选择素的表达,观察吞噬率与分子表达的相关性。(4)在(3)的吞噬体系中加入200mM的N-乙酰葡萄糖胺,观察吞噬率的变化。(5)用地塞米松多次注射昆明鼠建立免疫抑制动物模型,用碳粒廓清试验评价模型的可利用性。并建立鼠血中人血小板的流式细胞仪检测方法。(6)给地塞米松免疫抑制小鼠输注新鲜和4℃、22℃分别保存2d的血小板,在输注后15min,2h,4h,8h眼眶取血,以15min时鼠血中检出的人血小板为100%,计算各时间点人血小板的回收率。(7)取1d的血小板以65%的比例加入添加液(PAS-R2),并在其中分别添加海藻糖、DMSO和葡萄糖,4℃冷藏保存2d时,取样做THP-1细胞吞噬试验和小鼠输注实验,检测吞噬率和血小板回收率;冷藏7d时,检测体外质量指标,观察保护剂对冷藏血小板的保护作用。结果:在血浆中保存5d后,4℃保存的血小板计数、pH值与室温保存血小板无显著差异(P＞0.05)。平均血小板体积显著高于室温保存的血小板(P＜0.05);低渗休克率显著低于室温组(P＜0.05);ADP诱导的血小板聚集率显著高于室温组(P＜0.05)。观察在血浆中保存1d-10d的血小板,室温保存的血小板GPIbα的平均荧光强度(MFI)呈现逐渐下降的趋势,而冷藏血小板的表达未见显著变化;两种温度条件下保存的血小板随时间延长P-选择素表达均呈逐渐增加趋势,且保存期末室温组表达显著高于冷藏组(P＜0.05);血浆中冷藏保存5天的血小板,THP-1细胞对室温组和冷藏组的吞噬率均随GPIbα荧光强度的增强而降低(R=0.7,0.68);在吞噬体系中加入200mM的N-乙酰葡萄糖胺,室温组和冷藏组吞噬率均显著降低(P＜0.05)。地塞米松免疫抑制小鼠碳粒廓清试验表明,地塞米松小鼠的廓清指数(K)和吞噬指数(a)均显著低于对照组(P＜0.05);给地塞米松小鼠输注新鲜的和分别在4℃和22℃保存2d的血小板,结果表明,22℃保存血小板的与新鲜血小板在输注后2h、4h和8h的血小板回收率有显著差异(P＜0.05),与4℃保存的血小板未见显著差异(P＞0.05)。在血小板冷藏添加液PAS-R2中添加海藻糖、DMSO和葡萄糖冷藏保存血小板2d,THP-1细胞吞噬试验表明,添加葡萄糖对吞噬率无显著影响;添加DMSO吞噬率有所下降,但无显著差异(P＞0.05);而添加海藻糖则能显著降低血小板吞噬率(P＜0.05)。小鼠输注实验的8h回收率显示,添加DMSO与对照组有显著差异(P＜0.05),而葡萄糖和海藻糖则无显著差异;保存7d时检测血小板的体外质量指标发现,添加葡萄糖组的HSR,GPIbα表达的MFI显著低于对照组(P＜0.05),葡萄糖消耗和乳酸生成显著高于对照组(P＜0.05);添加DMSO组的PH,GPIbα的MFI显著均高于对照组(P＜0.05),而添加海藻糖组的体外指标与对照组无显著差异(P＞0.05)。结论:冷藏对血小板造成的损伤与22℃室温保存不同,主要表现在:1)血小板形态发生不可逆的改变,血小板平均体积显著增大;2)低渗休克率显著下降,血小板膜的完整性受到破坏;3)血小板聚集率显著高于22℃保存血小板4)相对于冷藏血小板,室温保存血小板的识别清除主要依赖于GPIbα的表达,而冷藏血小板可能还存在其他途径;N-乙酰葡萄糖胺可特异性的阻断THP-1细胞对冷藏或室温保存血小板的吞噬。地塞米松免疫抑制小鼠模型,可用于评价人血小板输注后的体内回收率。低温保护剂海藻糖和DMSO可能对冷藏血小板有一定的保护作用;冷藏条件下血浆中携带的葡萄糖足以维持血小板代谢需求,额外添加葡萄糖将影响血小板的体外活力,对提高冷藏血小板体内回收率无显著作用。

全文目录


中文摘要  4-6
Abstract  6-9
前言  9-11
材料与方法  11-21
结果与分析  21-36
讨论  36-40
结论  40-41
参考文献  41-44
综述  44-50
  参考文献  48-50
致谢  50-51

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 医用一般科学 > 生物医学工程 > 生物医学工程的其他分支 > 低温生物医学
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