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cDNA-AFLP技术分离桂花香气相关基因

作　者: 张园
导　师: 王平
学　校: 福建农林大学
专　业: 园林植物与观赏园艺
关键词: 桂花(Osmanthus Fragrans) 香味相关基因差异基因 cDNA-AFLP
分类号: S685.13
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 303次
引　用: 4次
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内容摘要

桂花(Osmanthus Fragrans)是木犀科木犀属的代表种,是优良的园林绿化树种和香花树种。本研究以桂花的花蕾为材料,运用cDNA-AFLP技术,分离桂花花香形成过程中差异片段,通过克隆测序, BLAST分析,获得的6个可能与香味相关的基因片段,为下一步揭示桂花香味物质代谢途径奠定基础,希望为花卉香味的遗传改良提供一条新途径,主要试验结果如下:1建立适合桂花花蕾总RNA的提取技术体系采用改良热硼酸法,改良Tris-硼酸法,试剂盒提取桂花花蕾总RNA,比较结果显示试剂盒法提取的总RNA,条带完整,质量好,纯度高,适合开展试验。2利用cDNA-AFLP技术分离桂花花香形成过程中差异基因采用末端两个选择性碱基的16条EcoR I引物和16条Mse I进行选择性扩增,共256对引物组,通过筛选,确定160对引物组进行扩增。试验共回收差异条带100带,获得50条测序结果。在NCBI数据库中进行BLAST比对,发现有31条序列在nr库中搜索到相似性较高的基因。另外17条序列没有搜索到同源序列,推测为未知基因。分析显示31个TDFs中6个TDFs可能与植物香气成分相关,分别命名为2OGox2,C4H1,CCD4,AACT ,CFAT,LOX。3采用RT-PCR技术分离CFAT和LOX的3′端序列选取其中两个可能与桂花香气相关基因片段CFAT和LOX,设计引物,采用RT-PCR技术扩增其3′端序列,分别进行克隆、测序和拼接,获得了CFAT 3′末端,共862bp,LOX 3′末端,共1588bp。本研究将为进一步研究桂花花香相关物质的代谢途径,以及为花卉香味的遗传改良奠定基础。

全文目录

缩写词  9-10
摘要  10-11
ABSTRACT  11-13
第一章前言  13-26
  1 研究背景  13
  2 文献综述  13-20
    2.1 桂花香味物质研究进展  13-14
    2.2 花卉香味物质的种类及合成途径  14-16
      2.2.1 萜类物质代谢途径  15-16
      2.2.2 苯丙烷类代谢途径  16
      2.2.3 脂肪酸衍生物代谢途径  16
    2.3 花卉香味物质合成途径中几个重要酶的研究进展  16-18
      2.3.1 类胡萝卜素裂解双加氧酶研究进展  16-17
      2.3.2 肉桂酸-4-羟化酶研究进展  17-18
      2.3.3 脂肪氧化酶的研究进展  18
    2.4 花卉香味基因工程研究进展  18-20
      2.4.1 国外香味基因工程研究进展  19-20
      2.4.2 国内研究进展  20
  3 差异表达基因的分离方法  20-24
    3.1 mRNA 差异显示技术  21
    3.2 抑制消减杂交  21-22
    3.3 cDNA 代表性差异分析  22
    3.4 基因表达系列分析法  22
    3.5 cDNA 微列阵  22-23
    3.6 cDNA-AFLP 技术研究进展  23-24
      3.6.1 cDNA-AFLP 技术的基本原理和实验流程  23
      3.6.2 cDNA-AFLP 技术的优点  23-24
      3.6.3 cDNA-AFLP 技术的应用  24
  4 研究的目的及意义  24-25
  5 本研究的技术路线  25-26
第二章桂花花蕾总 RNA 提取和 cDNA –AFLP 体系的建立  26-46
  1 试验材料  26-27
    1.1 材料  26-27
    1.2 主要仪器与试验试剂  27
  2 试验方法  27-38
    2.1 桂花总RNA 的提取及检测  27-30
      2.1.1 改良热硼酸盐法提取组织总RNA  27-28
      2.1.2 改良的Tris-硼酸法  28-29
      2.1.3 百泰克植物多糖多酚提取试剂盒  29-30
    2.2 RNA 质量检测  30-31
      2.2.1 电泳检测  30
      2.2.2 紫外分光光度测定  30-31
    2.3 cDNA-AFLP 分析  31-36
      2.3.1 双链cDNA 的合成及纯化  31-32
      2.3.2 cDNA-AFLP 分析  32-36
    2.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳  36-38
      2.4.1 制胶  36-37
      2.4.2 电泳  37
      2.4.3 银染  37-38
  3 结果与分析  38-43
    3.1 桂花花瓣总RNA 的提取  38-39
    3.2 预扩增结果  39-40
    3.3 选择性扩增产物聚丙烯酰胺凝胶电泳结果分析  40-43
    3.4 cDNA差异条带的选择  43
  4 讨论  43-46
    4.1 桂花花瓣总RNA 的提取  43-44
    4.2 cDNA-AFLP 试验体系  44-46
      4.2.1 cDNA-AFLP 技术的优点  44
      4.2.2 cDNA-AFLP 技术的注意事项  44-46
第三章差异片段的分离与分析  46-61
  1 试验试剂  46
  2 试验方法  46-49
    2.1 差异片段的回收  46
    2.2 差异片段的二次扩增  46-47
    2.3 差异片段纯化  47
    2.4 目的片段与 pMD18-T -vector 的连接  47-48
    2.5 大肠杆菌 DH5α 感受态细胞的制备——CaCl_2法  48
    2.6 连接产物的转化  48-49
    2.7 重组质粒的PCR 检测  49
    2.8 序列测定及分析  49
  3 结果与分析  49-58
    3.1 差异片段的二次扩增  49-50
    3.2 TDFs 的序列分析结果  50-58
  4 讨论  58-61
    4.1 萜类合成路径中的酶  58-59
    4.2 苯丙烷类代谢途径中的酶  59
    4.3 脂肪酸衍生物合成途径的主要调控酶  59-61
第四章利用 RT-PCR 技术分离 CFAT, LOX cDNA 3′端序列  61-69
  1 材料与方法  61-64
    1.1 材料  61
    1.2 方法  61-64
      1.2.1 总RNA 的提取及cDNA 第一链的合成  61-62
      1.2.2 引物设计  62
      1.2.3 利用RT-PCR 技术扩增CFAT, LOX 片段3′序列  62-64
    1.3 目的片段的回收纯化、克隆、测序  64
    1.4 序列分析  64
  2 结果与分析  64-68
    2.1 总 RNA 的提取及 cDNA 第一链的合成  64-65
    2.2 利RT-PCR 技术扩增CFAT、LOX 片段3′序列  65-66
    2.3 PCR 产物序列分析  66-68
      2.3.1 CFAT 3′PCR 产物序列分析  66-67
      2.3.2 LOX 3′PCR 产物序列分析  67-68
  3 讨论  68-69
第五章小结  69-70
参考文献  70-79
致谢  79

cDNA-AFLP技术分离桂花香气相关基因

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