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利用基因芯片研究Gankyrin表达抑制对结肠癌SW480细胞基因表达谱的影响

作　者: 马骞
导　师: 周涛
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 细胞生物学
关键词: Gankyrin 表达谱芯片差异基因
分类号: R735.35
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 51次
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内容摘要

Gankyrin ( PSMD10 )是近年来新发现的一个癌蛋白,由226个氨基酸组成,内含七个ankyrin重复序列,在结构上高度保守。Gankyrin是26S泛素蛋白酶体的调解亚单位,能够特异地结合19S调节子的S6b ATPase。最初发现Gankyrin在多种肝癌细胞中高表达。初步研究表明Gankyrin在细胞内发挥多种功能,能够与RB发生相互作用,在体内和体外促进RB的泛素化降解;能够增强Mdm2的泛素E3酶活性进而促进Mdm2对P53的降解;能够与Cdk4结合,在细胞周期调控中发挥重要作用,拮抗p16INK4A和p18INK4C2的抑癌功能;还能与RelA发生相互作用,抑制NF-κB通路的活性。此外,在Ras转化的NIH3T3细胞中Gankyrin被显著上调,提示Gankyrin可能参与了Ras诱导的细胞转化过程。上述研究提示Gankyrin参与了肿瘤细胞内多种信号通路。但目前国内外对Gankyrin功能的研究并不深入,Gankyrin在细胞生长、代谢、凋亡等生理过程中,尤其是在肿瘤细胞增殖、浸润、迁移过程中发挥的功能尚不清楚。为了探明Gankyrin在肿瘤的发生、发展、转移过程中的功能,寻找肿瘤细胞中Gankyrin参与的信号通路,本研究尝试利用高通量基因表达谱芯片技术,分析Gankyrin稳定干涉后SW480人结肠癌细胞中基因表达的变化,筛选出显著变化的基因,为深入研究Gankyrin的功能奠定基础。本研究首先制备细胞样品,完成芯片杂交实验。随后应用多种数据分析方法,对芯片结果进行分析,筛选出78种显著变化的基因,并通过RT-PCR和Real-time PCR验证了其中部分基因,证实了芯片结果的可靠性。进一步对芯片结果进行了pathway分析,分析了Gankyrin发挥功能参与的信号通路。结果表明Gankyrin广泛参与了细胞内的多种生理/病理活动,特别是对肿瘤细胞增殖、迁移、侵润等多种通路都具有潜在的调节作用。研究结果为深入探索Gankyrin的功能机制,尤其是Gankyrin在肿瘤细胞信号转导调控中的作用提供了依据和线索。

全文目录

缩略词表  7-8
摘要  8-9
Abstract  9-11
引言  11-12
第一部分样品制备与芯片实验  12-19
  前言  12-14
  材料与方法  14-16
    1. 材料及来源  14
      1.1 细胞培养试剂  14
      1.2 主要试剂和抗体  14
      1.3 芯片实验中所用的试剂与仪器  14
    2. 实验方法  14-16
      2.1. pSuper-hGankyrin 载体的构建  14
      2.2. SW 稳定干涉细胞  14-15
      2.3 提取RNA  15
      2.4 芯片后续实验  15
      2.5. western blot 分析  15-16
  结果与分析  16-18
    1. 对照组细胞与干涉组细胞中Gankyrin 的表达  16
    2. 总RNA 抽提及芯片杂交  16-17
    3. 实验对照  17
    4. 芯片杂交及检测流程  17-18
  小结  18-19
第二部分表达谱芯片的数据分析  19-29
  前言  19-21
  材料与方法  21-22
  结果与讨论  22-28
    1. 显著差异基因筛选标准  22
    2. 差异表达基因的筛选  22
    3. 差异基因的分析  22-25
      3.1. GO 分析  22-24
      3.2. pathway 分析  24-25
    4. 筛选感兴趣基因  25-28
      4.1. AKAP12  26
      4.2. MMP10  26-27
      4.3. CTHRC1  27
      4.4. CTSB  27
      4.5 FERMT2  27
      4.6 ARHGAP  27-28
  小结  28-29
第三部分芯片结果中差异基因的验证  29-36
  前言  29-30
  材料与方法  30-33
    1. 材料及其来源  30
      1.1 实验材料  30
        1.1.1 主要仪器设备  30
        1.1.2 主要试剂  30
        1.1.3 引物设计  30
    2 方法  30-33
      2.1 引物设计  30-31
      2.2. RT-PCR 反应  31-33
        2.2.1 RNA 抽提  31
        2.2.2 逆转录  31
        2.2.3 聚合酶链式反应  31-33
  结果与讨论  33-35
    1. 感兴趣基因的文献调研  33
    2.Reverse Transcription-PCR 结果与芯片结果相符  33-34
    3. Real-time-PCR 结果  34-35
  小结  35-36
总结  36-37
参考文献  37-40
文献综述  40-47
个人简历  47
攻读硕士期间发表的文章  47-48
致谢  48-49

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