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高低代次高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的Marc-145细胞适应性差异研究

作　者: 韩明远
导　师: 宁宜宝
学　校: 中国兽医药品监察所
专　业: 预防兽医学
关键词: 猪繁殖与呼吸综合征病毒 Macr-145细胞适应性消减抑制杂交差异基因
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome, PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus, PRRSV)引起的一类能够致使怀孕母猪流产和仔猪呼吸障碍的疾病。PRRSV具有严格的宿主细胞嗜性,只有少数几个细胞系适合PRRSV的感染与增殖。包括细胞受体与胞内大分子物质在内的多个因素影响PRRSV感染宿主细胞的过程。PRRSVGD株体外传代的过程中,各代次的TCID50值随代次增加而上升。将体外传5代与100代的PRRSV GD株感染Marc-145细胞,两者产生CPE的时间差异较大,5代需要34小时,而100代则缩短为24小时。通过对5代至100代之间PRRSV GD株的基因组全序列进行测序分析,在体外传代过程中,基因组全序列共有29个碱基发生了突变,这些突变导致了18个氨基酸突变的发生。约有77.8%的氨基酸突变发生在50代之前,而66.7%的氨基酸突变发生在编码非结构蛋白的开放阅读框中。使用UTRscan对5’UTR功能元件进行分析,没有变化发生。PRRSV GD株不同代次之间基因结构的变化可能是导致不同代次病毒在Marc-145细胞上细胞适应性差异的原因之一。由于编码非结构蛋白与编码结构蛋白的ORF中均有氨基酸基突变的发生,很难说明哪类氨基酸突变导致了病毒宿主细胞适应性的变化。PRRSV对于细胞基因组转录调控的差异可能是造成宿主细胞适应性差异的重要原因之一。通过使用消减抑制杂交技术,构建能够反映感染不同代次PRRSV GD株Marc-145细胞mRNA转录差异的表达基因cDNA差异文库。选取感染后12小时、24小时和36小时3个时间点观察在不同时间差异基因的情况。通过对差异基因测序并BLAST,发现11种来源于Marc-145细胞与灵长类动物高度同源的基因和4种未知基因为转录差异基因。11种已知基因中有6个是核糖体蛋白基因。然而由于针对这些基因的研究较少,这些基因的功能尚不清楚。实验结果说明感染高低代次PRRSV GD株的Marc-145细胞基因转录情况确实存在差异,这种差异可能与宿主细胞适应性差异有关。

全文目录

摘要  3-4
ABSTRACT  4-5
插图和附表清单  5-6
英文缩写表  6-7
目录  7-9
第一章引言  9-20
  1.1 高致病性蓝耳病的研究进展  9-12
    1.1.1 HP-PRRSV的遗传学分析  9-10
    1.1.2 HP-PRRSV致病力的研究  10
    1.1.3 检测方法  10-11
    1.1.4 HP-PRRSV疫苗研究  11-12
  1.2 影响PRRSV感染宿主细胞的因素  12-16
    1.2.1 细胞受体  12-14
    1.2.2 胞内大分子物质  14-15
    1.2.3 细胞因子的作用  15
    1.2.4 小结  15-16
  1.3 实验研究内容与主要方法  16-19
    1.3.1 实验研究内容  16
    1.3.2 实验主要方法-消减抑制杂交技术  16-19
  1.4 研究的目的与意义  19-20
第二章 PRRSV GD株不同代次间Marc-145细胞适应性比较与基因组全序列的测定  20-34
  2.1 材料  20-22
    2.1.1 细胞与毒株  20
    2.1.2 生物试剂  20-21
    2.1.3 溶液配制  21
    2.1.4 主要仪器设备  21-22
  2.2 实验方法  22-26
    2.2.1 Marc-145细胞的培养  22
    2.2.2 PRRSV GD株的体外传代  22
    2.2.3 PRRSV GD株体外传代各代次TCID_(50)值的测定  22
    2.2.4 PRRSV GD株体外传代各代次CPE产生时间的观察  22-23
    2.2.5 总RNA的提取  23
    2.2.6 RT-PCR  23-25
    2.2.7 PCR产物电泳验证  25
    2.2.8 PRRSV GD株各代次基因组全序列测序结果的分析  25
    2.2.9 PRRSV GD株基因组全序列5'UTR的序列分析  25-26
  2.3 实验结果  26-32
    2.3.1 PRRSV GD株体外传代各代次TCID_(50)值  26-27
    2.3.2 PRRSV GD株体外传代各个代次CPE时间观察结果  27-28
    2.3.3 PCR扩增产物电泳检测结果  28
    2.3.4 高低代次PRRSV GD株基因组全序列碱基突变分析  28-30
    2.3.5 高低代次PRRSV GD株基因组全序列氨基酸突变分析  30-32
    2.3.6 PRRSV GD传代毒株5'UTR的序列分析  32
  2.4 讨论  32-34
第三章 Marc-145细胞基因转录差异文库的建立  34-50
  3.1 实验材料  34-37
    3.1.1 细胞与毒株  34
    3.1.2 生物试剂  34-35
    3.1.3 溶液配制  35-36
    3.1.4 主要仪器设备  36-37
  3.2 实验方法  37-44
    3.2.1 Marc-145细胞的培养  37
    3.2.2 PRRSV GD株5代与100代感染Marc-145细胞CPE产生时间观察  37
    3.2.3 mRNA的提取  37-38
    3.2.4 mRNA第一链cDNA的合成  38
    3.2.5 第二链cDNA合成  38-39
    3.2.6 双链cDNA末端修饰  39
    3.2.7 双链cDNA的RsaⅠ酶切消化  39
    3.2.8 接头的制备  39-40
    3.2.9 消化产物与接头连接  40
    3.2.10 消减抑制杂交  40-41
    3.2.11 套式PCR扩增差异基因  41-42
    3.2.12 PCR产物与T载体连接  42
    3.2.13 构建载体的转化与克隆  42-43
    3.2.14 检测与测序  43
    3.2.15 构建文库的序列分析  43-44
  3.3 实验结果  44-48
    3.3.1 PRRSV GD体外传代毒株5代与100代感染Marc-145细胞之后CPE产生情况  44
    3.3.2 RsaⅠ酶切图  44-45
    3.3.3 PCR检测图  45-47
    3.3.4 差异基因文库的构建  47-48
  3.4 讨论  48-50
第四章结论  50-51
  4.1 实验总结  50
  4.2 下一步工作设想  50-51
参考文献  51-56
致谢  56-57
作者简历  57

高低代次高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的Marc-145细胞适应性差异研究

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