学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

抗猪囊尾蚴单克隆抗体轻重链可变区基因扩增和序列分析

作　者: 种法政
导　师: 赵权
学　校: 吉林农业大学
专　业: 临床兽医学
关键词: 猪囊尾蚴 轻重链可变区基因 扩增与序列分析
分类号: S852.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
下　载: 31次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载
 

内容摘要


猪囊尾蚴病是由猪带绦虫的幼虫（囊尾蚴）引起的一种人畜共患病。我国人体囊尾蚴病分布广泛,严重威胁着广大人民健康。多年来防治本病主要是以药物防治为主,但是由于抗药性的不断出现及药物残留等问题的严重性,限制了其在临床上的应用。进入20世纪80年代后,分子生物学技术的快速发展促进了抗体研究的进展,基因工程抗体应运而生。其中单链抗体是目前应用最为广泛的重组抗体,在各个领域均有大量研究报道。但在寄生虫研究中尤其是猪囊尾蚴领域没有单链抗体的报道。本实验克隆出抗猪囊尾蚴单克隆抗体轻重链可变区基因片段,为抗猪囊尾蚴单链抗体的构建奠定了基础。方法:首先,复苏分泌抗猪囊尾蚴单克隆抗体杂交瘤细胞,培养至最佳生长状态,琼脂糖扩散试验检测分泌抗猪囊尾蚴单克隆抗体杂交瘤细胞的活性。取活性高的杂交瘤细胞,用Trizol一步法提取分泌抗猪囊尾蚴单克隆抗体杂交瘤细胞总RNA。然后,根据genebank公布的相关序列,合成两对特异性引物,以提取的总RNA为模板,经一步法RT-PCR反应扩增抗体轻重链可变区基因。最后,将扩增抗体轻重链可变区基因与克隆载体pMD18-T连接,琼脂糖电泳检测后,转化于感受态细胞JM109。蓝白斑法筛选出阳性重组子进行菌落PCR鉴定。取含有阳性重组子的菌液送至生物公司测序。结果:提取分泌抗猪囊尾蚴单克隆抗体的杂交瘤细胞总RNA后,应用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测提取得总RNA。结果显示:A260/280值=1.96;RNA琼脂糖凝胶电泳可以清晰地看到28sRNA,18sRNA的条带。证明得到了能够分泌抗猪囊尾蚴特异性单克隆抗体杂交瘤细胞总RNA。以提取的总RNA为模板,一步法RT-PCR反应扩增抗体轻重链可变区基因。经琼脂糖凝胶电泳检测,轻链可变区基因和重链可变区基因长度在400bp左右,符合鼠抗体特征,表明得到了抗猪囊尾蚴单克隆抗体轻重链可变区基因片段。经琼脂糖凝胶电泳检测回收后连接克隆载体pMD18-T,转化感受态细胞JM109,蓝白斑法筛选出阳性重组子,以通用引物对阳性重组子进行鉴定,菌落-PCR检测证明重组子为阳性。测序结果显示:重链可变区基因全长为357bp,编码119个氨基酸;轻链可变区基因全长315bp,编码105个氨基酸。同源性比较结果显示:重链的同源性为94%,轻链的同源性为96%,符合鼠抗体轻链可变区和重链可变区基因特征。抗原表位互补结合的互补决定区（CDR）基因有多数发生改变,且在重链可变区基因的CDR2中有基因缺失现象,轻链可变区基因的CDR3中有基因缺失现象。

全文目录


摘要  5-6
Abstract  6-10
前言  10-12
第一章 猪囊尾蚴病简介  12-15
  1 猪囊尾蚴流行病学  12-15
    1.1 流行新特点  12
    1.2 流行原因  12-13
    1.3 感染与危害  13-15
第二章 猪囊尾蚴病病原入侵与免疫机制研究进展  15-20
  1 病原入侵致病作用及免疫逃避机制  15-20
    1.1 病源入侵与之致病机制  15-16
    1.2 病原感染时的机体免疫反应  16-17
    1.3 囊尾蚴免疫抑制的研究进展  17-20
第三章 囊虫病防治研究进展  20-27
  1 国内外疫苗研究进展  20-23
    1.1 蛋白质疫苗  20-22
    1.2 核酸疫苗  22-23
  2 抗体研究进展  23-27
    2.1 单克隆抗体的研究进展  23-24
    2.2 单链抗体的研究进展  24-27
第四章 实验内容  27-41
  1 材料与方法  27-32
    1.1 材料与仪器  27-29
    1.2 方法  29-32
  2 结果  32-38
    2.1 RNA紫外分光光度计检测  32
    2.2 电泳检测结果  32-33
    2.3 轻重链可变区基因的PCR扩增及鉴定  33-34
    2.4 轻重链可变区基因片段回收产物检测  34
    2.5 轻链可变区基因的重组质粒PCR鉴定  34
    2.6 重链可变区基因的重组质粒PCR鉴定  34-35
    2.7 轻重链可变区基因测序结果及其分析  35-38
  3 讨论  38-40
    3.1 单链抗体的构建  38
    3.2 RNA的分离  38
    3.3 RT-PCR反应  38-39
    3.4 重组质粒转化感受态细胞  39
    3.5 阳性重组质粒鉴定  39
    3.6 测序  39
    3.7 轻重链可变区序列分析  39-40
  4 结论  40-41
参考文献  41-46
附录Ⅰ  46-47
致谢  47-48
个人简介  48

相似论文

  1. 亚洲型猪囊尾蚴3个低分子量抗原基因的克隆、表达及ELISA检测方法的建立,S852.7
  2. 猪囊尾蚴pVAX1-AgB重组质粒的免疫效果研究,S852.7
  3. 抗猪囊尾蚴特异IgG4重组抗原的制备与鉴定,R392
  4. 抗猪囊尾蚴特异性卵黄抗体的制备与鉴定及其诊断猪囊尾蚴病作用研究,S858.28
  5. 抗猪囊尾蚴特异性单链抗体基因的克隆与序列分析,S858.28
  6. 亚洲型猪囊尾蚴排泄分泌抗原M13h基因的克隆与表达,S858.28
  7. 仔猪人工感染囊尾蚴后体液免疫和细胞免疫变化规律的研究,S858.28
  8. 抗猪囊尾蚴头节单克隆抗体的制备、特性鉴定及初步应用,S858.28
  9. 猪囊尾蚴的能量代谢变化规律和药物作用机理研究,S858.28
  10. 膜联蛋白家族新成员的克隆及其结构与功能的研究,Q51
  11. 膜联蛋白家族新成员的结构，功能和进化,Q51
  12. 猪囊尾蚴的生化代谢规模和药物作用机理,S852.7
  13. 一个新的猪囊尾蚴蛋白的cDNA分子筛选、克隆、表达与鉴定,R392
  14. 猪囊尾蚴cDNA文库的免疫学筛选及基因的克隆、表达及鉴定,R392
  15. 猪带绦虫六钩蚴TSOL18基因密码子优化真核载体的构建及其在体内、外表达的实验研究,R346
  16. 猪囊尾蚴单链抗体PE40重组载体构建,S852.7;R392
  17. 两种苹果酸脱氢酶的克隆、表达及酶学分析,Q946.5
  18. 一株苜蓿花叶病毒的全基因组序列及其寄主生物学研究,S435.4
  19. 猪囊尾蚴dUTPase的表达、活性分析及结构预测,S852.7
  20. 猪囊尾蚴发育过程中可溶性蛋白的变化及其抗原性的分析,S852.7

中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医基础科学 > 家畜寄生虫学
© 2012 www.xueweilunwen.com