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对硫磷单克隆抗体的制备及电化学免疫传感器的初步研究

作　者: 许园园
导　师: 潘家荣
学　校: 中国农业科学院
专　业: 农产品加工及贮藏工程
关键词: 对硫磷人工抗原细胞融合单克隆抗体电化学免疫传感器
分类号: TP212.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

我国是农药第一大生产国,同时是第二大消费国,农药污染问题严重。虽然国家已经禁止使用甲胺磷、对硫磷等高毒农药,但是国内仍然存在偷用、滥用情况,因此存在着食品安全隐患。传统的检测方法由于前处理复杂、仪器昂贵等缺点具有一定的局限性,因此迫切需要建立一种快速有效检测农药残留的方法。电化学免疫传感器既具有免疫传感器选择性好、种类多、测试费用低、适合联机化等优点,又具有电化学体系可实现在体检测、不受样品颜色、浊度的影响(样品不需复杂预处理,不需分离)、所需仪器相对简单的优点,能广泛用于医疗、食品分析、工业生产、环境检测等领域,是生物传感器研究的热点之一。因此,本课题以对硫磷和甲基对硫磷为研究对象,制备了对硫磷的单克隆抗体,并利用实验室制备的甲基对硫磷多克隆抗体建立了测定甲基对硫磷的电化学免疫传感器检测方法。主要研究结果如下:1.对硫磷人工抗原的合成和鉴定针对对硫磷没有免疫原性的特点,根据其分子结构特点将对硫磷还原为氨基对硫磷,利用重氮化法分别以牛血清蛋白和卵清蛋白为载体蛋白合成了人工免疫抗原和包被抗原。利用核磁共振波谱法对人工免疫抗原和包被原进行鉴定,结果表明氨基对硫磷的化学位移与文献报道值相符,对硫磷成功还原为氨基对硫磷。同时偶联物的磷谱较载体蛋白与氨基对硫磷有明显变化,进一步证明对硫磷人工抗原合成成功。紫外分光光度法测得人工合成的免疫原与包被原与载体蛋白的偶联比分别为32:1与25:1。2.对硫磷单克隆抗体细胞株的制备、纯化、鉴定与应用研究利用人工免疫抗原免疫Balb/c小鼠,四周后测定小鼠尾血血清效价,达到104以上时选取效价高的小鼠进行细胞融合。以PEG 4000为融合剂,将小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合,以HAT培养基选择培养,以间接ELISA法筛选有阳性的杂交瘤细胞株,再经有限稀释克隆法得到能分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。间接ELISA检测2号小鼠尾血血清的效价可达到105,细胞融合的融合率为90%,阳性率为3.7%,得到的细胞株能稳定分泌抗对硫磷单克隆抗体。间接ELISA测定得到的抗体亚类为IgG,亲和力常数为1.6×105L/mol。以扩增后的杂交瘤细胞株诱导小鼠产生腹水,间接ELISA测定腹水效价可以达到105,经正辛酸-硫酸铵沉淀法纯化腹水得到了单克隆抗体,紫外分光光度法测定蛋白质的含量为9.008mg/mL。建立了对硫磷的间接竞争ELISA检测方法,检测线性范围在0.071μg/mL-0.4951μg/mL,最低检测限为(抑制率为10%时的浓度值)为0.05μg/mL。3.电化学传感器的制备利用自组装技术将三巯基丙酸固定在金电极上,以1-乙基-3-(3-二甲氨基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基硫代琥珀亚胺(NHS)作为活化剂,将甲基对硫磷抗体以共价键形式固定在三巯基丙酸自组装单分子膜修饰的金电极上,制备了一种免疫传感器。根据抗体与抗原之间特异反应前后电极电位的变化对甲基对硫磷进行定量测定,该传感器的检测下限为0.085μg/mL,检测范围为0.5-15μg/mL,并可以再生、重复利用。

全文目录

摘要  5-6
Abstract  6-11
第一章绪论  11-20
  1.1 研究目的意义  11-12
  1.2 国内外文献综述  12-20
    1.2.1 农药免疫检测技术研究方法  12-13
    1.2.2 电化学传感器  13-16
    1.2.3 电化学传感器在食品安全中的应用  16-18
    1.2.4 电化学传感器的发展前景  18-20
第二章对硫磷人工抗原的制备及鉴定  20-27
  2.1 材料与方法  20-22
    2.1.1 仪器与试剂  20
    2.1.2 方法  20-22
  2.2 结果  22-24
    2.2.1 核磁共振波谱分析结果  22-23
    2.2.2 偶联比测定结果  23-24
  2.3 小结和讨论  24-27
第三章对硫磷单克隆抗体细胞株的制备、纯化和鉴定  27-42
  3.1 材料与方法  27-33
    3.1.1 材料与仪器  27-29
    3.1.2 方法  29-33
  3.2 结果  33-38
    3.2.1 间接 ELISA 法确定包被抗原的浓度  33
    3.2.2 免疫小鼠多抗血清检测结果  33-34
    3.2.3 细胞克隆的形成和单克隆抗体细胞株的筛选  34-36
    3.2.4 单克隆抗体免疫球蛋白类别、亚类鉴定及亲和力常数确定  36
    3.2.5 纯化后抗体蛋白质含量  36
    3.2.6 抗原抗体工作浓度确定  36
    3.2.7 对硫磷竞争曲线及检测限确定  36-37
    3.2.8 纯化后对硫磷单克隆抗体特异性的测定  37-38
  3.3 小结和讨论  38-42
第四章甲基对硫磷电化学传感器的研制  42-48
  4.1 材料与方法  42-43
    4.1.1 材料与仪器  42-43
    4.1.2 方法  43
  4.2 结果  43-46
    4.2.1 对金电极固定过程的电化学表征  43-44
    4.2.2 免疫传感器对游离抗原的响应  44-45
    4.2.3 传感器的再生  45
    4.2.4 检出限的确定及免疫传感器的电位响应性能  45-46
    4.2.5 免疫传感器的重现性和稳定性  46
  4.3 小结与讨论  46-48
第五章全文主要结论及展望  48-49
  5.1 主要结论  48
  5.2 工作展望  48-49
参考文献  49-53
致谢  53-54
作者简介  54

对硫磷单克隆抗体的制备及电化学免疫传感器的初步研究

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