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重组Thermobifida fusca角质酶在大肠杆菌中的分泌表达研究

作　者: 刘志国
导　师: 陈坚
学　校: 江南大学
专　业: 发酵工程
关键词: Thermobifida fusca角质酶大肠杆菌分泌强化膜蛋白敲除 TIR突变化学添加剂
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

角质酶（cutinase,EC 3.1.1.74）是一类可水解各种长链、短链脂肪酸酯,以及可降解不溶性角质等的水解酶,属于α/β水解酶家族。角质酶作为一种多功能水解酶,在食品、化工、洗涤、造纸等诸多领域都具有广泛的应用。近年来,角质酶在纺织工业中的应用潜力逐渐被人们挖掘。角质酶可破坏棉纤维角质层,并帮助去除果胶、蛋白质等杂质从而达到纺织品的精练效果。本研究室在前期研究工作中,首次鉴定并表达了一种来源于嗜热子囊菌（Thermobifida fusca）的细菌角质酶Tfu₀883,发现其具有热稳定性好,耐高温,耐极端pH等优良特性,符合工业化应用的实际需求,具有巨大的产业化应用潜力。本研究在此基础上,以发酵常用菌株BL21 Star（DE3）为表达宿主菌,通过对其表达分泌系统的探究与改造以期获得重组角质酶高效胞外分泌的最佳策略。本研究的具体内容及成果包括以下方面:1、对外膜脂蛋白基因lpp进行了成功的敲除,并初步考察了敲除菌的生长及发酵产酶情况。鉴于细胞膜透性在重组蛋白跨膜转运方面的重要地位,本研究首先以发酵常用菌株BL21 Star（DE3）为表达宿主菌,对细胞外膜的重要组成部分lpp外膜脂蛋白基因进行敲除,以增大其外膜透性。对敲除菌的进一步产酶研究发现,lpp敲除对于发酵前期影响明显,促进了重组角质酶在前期达到较高的胞外分泌水平,使发酵周期从之前的60h-72h缩短至36h-48h; 2、通过共表达SecA及SecM-SecA内膜转运伴侣蛋白,对增强内膜转运能力进行了探索性研究。重组蛋白的内膜转运是一系列涉及多种转运伴侣蛋白、膜蛋白以及其与重组蛋白相互作用的复杂过程,而内膜转运系统涉及诸如SecA特殊精密表达调控等复杂机理,是一项需要细致深入研究的系统工程。本研究从SecA表达调控机理入手,通过共表达SecA伴侣蛋白以及共表达SecM-SecA调控体系,考察内膜转运伴侣蛋白的过量表达对于重组角质酶胞外分泌的影响。根据细胞内仍有明显包涵体分析可知,由于表达强度与分泌能力不匹配,未完成折叠的重组角质酶在内膜附近形成无生物活性的包涵体,因此采用单纯共表达SecM-SecA等提高蛋白转运能力的单一手段并不能有效提高重组蛋白的胞外分泌效率;3、运用TIR突变技术,探索了低合成强度下角质酶高效胞外生产的潜力。从重组蛋白的合成强度入手,运用TIR简并突变技术,获得了从对照组的1/10到对照组4倍的合成梯度强度。从中选取合成强度减弱为一半的突变株,将该突变基因应用至pET表达系统,并以lpp敲除菌为宿主,对重组菌的生长及发酵进行了探索研究。研究发现,使用合成强度降低的重组载体在37℃下进行发酵生产分泌效率有明显的提高,发酵周期缩短。这表明,低合成强度下的重组蛋白胞外分泌有着进一步优化的潜力;4、考察了化学添加剂等对发酵产酶的影响,并优化了发酵策略。根据细胞膜转运重组蛋白的机理,本研究相继考察了各种金属离子、电子受体、表面活性剂等添加剂对发酵的影响研究发现,添加高价铁离子及硝酸根离子等电子受体离子,并不能通过增强电子传递链的效率来推动内膜转运的进程。作为一种非离子型表面活性剂,TritonX-100对于细胞膜透性有着良好的促进作用,当TritonX-100终浓度为0.1%时,菌体生长未受明显影响,而胞外产酶量及分泌比率均达到了80U/mL和60%,是原始出发菌株的2倍。

全文目录

摘要  3-5
Abstract  5-9
第一章绪论  9-15
  1.1 角质酶的概述  9-10
    1.1.1 角质酶的结构与功能  9-10
    1.1.2 角质酶的制备  10
  1.2 大肠杆菌表达分泌重组蛋白的概述  10-12
    1.2.1 大肠杆菌表达系统的介绍  10-11
    1.2.2 大肠杆菌主要分泌途径概述  11-12
  1.3 立题依据及意义  12-13
  1.4 主要研究内容  13-15
第二章实验材料与方法  15-25
  2.1 菌株与载体  15
  2.2 试剂与仪器  15-16
    2.2.1 主要试剂  15-16
    2.2.2 主要仪器  16
  2.3 培养方法  16-17
    2.3.1 培养基  16-17
    2.3.2 种子活化培养  17
    2.3.3 摇瓶发酵培养  17
  2.4 分子操作  17-23
    2.4.1 大肠杆菌感受态制作方法  17-18
    2.4.2 大肠杆菌基因组上的基因敲除  18-19
    2.4.3 引物设计  19
      2.4.3.1 基因敲除涉及的引物  19
      2.4.3.2 其他载体构建涉及的引物  19
    2.4.4 基本分子操作流程  19-22
      2.4.4.1 质粒的提取  20
      2.4.4.2 PCR 反应  20
      2.4.4.3 基因片段的胶回收  20-21
      2.4.4.4 限制性内切酶酶切体系  21
      2.4.4.5 基因与载体的连接  21-22
      2.4.4.6 化学转化与电转化  22
    2.4.5 重组载体的构建  22-23
  2.5 分析检测方法  23-25
    2.5.1 菌浓的检测  23
    2.5.2 角质酶酶活的测定  23
    2.5.3 聚丙烯酰胺凝胶蛋白电泳（SDS-PAGE）  23-25
第三章结果与讨论  25-45
  3.1 外膜渗漏型菌株的构建及其分泌能力研究  25-30
    3.1.1 外膜脂蛋白基因lpp 的敲除  25-27
      3.1.1.1 大肠杆菌BL21 Star（DE3）基因组的提取  25-26
      3.1.1.2 同源臂的设计及抗性基因的获得  26
      3.1.1.3 目的片段在基因组上的重组及转化子的验证  26-27
    3.1.2 lpp 膜脂蛋白基因敲除对重组角质酶胞外分泌的影响  27-30
  3.2 跨内膜转运强化探究  30-33
    3.2.1 伴侣蛋白SecA 的共表达  30-32
    3.2.2 伴侣蛋白SecM-SecA 的共表达  32-33
  3.3 低合成强度下的分泌强化探索  33-39
    3.3.1 低合成强度的获得—TIR 简并性突变技术与角质酶快速筛选技术的建立  34-38
      3.3.1.1 角质酶产生菌快速筛选方法的建立  34-35
      3.3.1.2 重组质粒pTRC99A /cutinase0883 的构建  35-36
      3.3.1.3 TIR 突变文库的初步建立  36-37
      3.3.1.4 低合成强度表达载体的获得  37-38
    3.3.2 低合成强度下外膜渗漏菌株的发酵初探  38-39
  3.4 低合成强度下lpp 外膜脂蛋白基因敲除菌的发酵培养条件优化  39-45
    3.4.1 铁离子与硝酸根离子对发酵产酶的影响  39-41
    3.4.2 其他化学添加剂的作用  41-45
第四章结论与展望  45-47
  4.1 结论  45-46
  4.2 展望  46-47
致谢  47-49
参考文献  49-53
附录:作者在攻读硕士学位期间发表的论文  53

重组Thermobifida fusca角质酶在大肠杆菌中的分泌表达研究

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