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鸡源大肠杆菌ESBLs基因型检测

作　者: 裴亚玲
导　师: 胡功政
学　校: 河南农业大学
专　业: 基础兽医学
关键词: 鸡大肠杆菌 ESBLs 多重耐药性 基因型 基因亚型
分类号: S852.61
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


大肠杆菌中产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)的检出率较高,其比例有逐年上升趋势,产ESBLs的多数菌株对青霉素类、第1、2、3代头孢菌素、喹诺酮类、磺胺类、氨基糖甙类等抗生素呈多重耐药。ESBLs由普通β-内酰胺酶TEM-1、TEM-2和SHV-1经个别氨基酸突变形成,由质粒介导,易在同种属甚至不同种属细菌间传递造成暴发流行。目前已发现有400多种,根据其质粒编码的基因和酶底物的不同,ESBLs基因型有TEM型、SHV型、CTX型、OXA型及其它型共5种,每个基因型又有很多亚型。细菌及其所受抗生素选择压力不同,其产生ESBLs的基因型、基因亚型亦不同。大肠杆菌中以TEM型和CTX-M型基因为主,PER、VEB、GES、BES等少见类型ESBLs也在不断增加。各个国家和地区使用的抗菌药物不同,流行的ESBLs基因型各不相同。ESBLs的传播性以及它们的多重耐药性给临床抗生素治疗造成了极大困难,及时准确检出ESBLs对防止ESBLs流行、控制医院内感染和指导临床治疗有着非常重要的意义。2007年5月至2008年12月间,我们用CLSI推荐的ESBLs初筛、确证试验方法、双纸片协同法对从河南省各地分离出的35株鸡源大肠杆菌进行ESBLs检测,用标准微量两倍稀释法及K-B纸片法检测其对常用抗菌药物及其联合使用的敏感性,并利用分子生物学方法对鸡源大肠杆菌进行耐药基因的初步分型检测。试验结果表明,35株鸡源大肠杆菌中有22株测出产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs),产ESBLs菌株对15种抗菌药的耐药率为0-100%,非产ESBLs菌对15种抗菌药的耐药率低于产ESBLs菌株,碳青酶烯类药物亚胺培南和阿米卡星对两种菌株的敏感率均为100%；而产ESBLs菌株对头孢类药物的耐药率为80%～95%,非产ESBLs菌株对第三代头孢类药物耐药率为23.1%,有着明显的差异；产ESBLs菌株对多种抗菌药表现出多重耐药性和交叉耐药性；β-内酰胺类抗生素与β-内酰胺酶抑制剂或其它类抗菌药联用均可明显提高产ESBLs菌对药物的抗菌活性。22株产ESBLs菌株用TEM型、SHV型引物经PCR扩增均扩增出861bp的特异性目的片断；而用CTX型引物经PCR扩增,扩增出905bp的特异性目的片断；用OXA型引物经PCR扩增,扩增出831bp的特异性目的片断。四对引物的序列如下：TEM型：上游引物：5′—GGGGATGAGTATTCAACATTTCC—3’,下游引物：5’—GGGCAGTTACCAATGCTTAATCA—3’;SHV型：上游引物：5’—GGTTATGCGTTATATTCGCCTGTG—3’,下游引物：5′—TTAGCGTTGCCAGTGCTCGATCA—3’; CTX-M;上游引物：5′GGGCTGAGATGGTGACAAAGAG—3’,下游引物：5’-CGTGCGAGTTCGATTTATTCAAC-3’;OXA型：上游引物：5’—TGAAGGGTTGGGCGATTT—3’,下游引物：5′—TTAGCGTTGCCAGTGCTCGATCA—3’.其中18株大肠杆菌质粒上携带有TEM片段,但TEM的基因亚型为TEM-1,归为广谱β-内酰胺酶,SHV型引物未扩增出目的片段,9株有CTX片段,6株同时有TEM和CTX片段,6株有OXA片段,5株同时有TEM-1和OXA-1,2株同时有TEM-1、CTX-M和OXA-1。PCR产物经克隆后测序,对序列结果分析表明,各种TEM型产酶菌的序列同源性为99.9%-100%,与GenBank上的EU979560相比,其中有两处突变位点,但没有引起氨基酸位点的突变,所以仍属于TEM-1型广谱酶。各种CTX型产酶菌的序列同源性为99.2%～100%,产酶菌株ESBLs的基因型分别为CTX-M-14、CTX-M-65、CTX-M-24,已提交的序列1148066与GenBank上已公布的序列EU213262 (CTX-M-65)和EF418608 (CTX-M-65)的同源性为100%,故为CTX-M-65型。已提交的序列1148088、1148090和1148092与GenBank上已公布的DQ304479序列(CTX-M-14)的同源性为100%,故均为CTX-M-14型。已提交的序列1148075与GenBank上已公布的EU418917序列(CTX-M-24)的同源性为100%,故为CTX-M-24型。

全文目录


致谢  5-7
摘要  7-9
1 文献综述  9-20
  1.1 鸡大肠埃希菌的耐药现状  9-10
  1.2 大肠埃希菌的多重耐药机制  10-17
  1.3 大肠埃希菌耐药性对人类的危害  17
  1.4 控制大肠埃希菌耐药性的策略  17-20
2 引言  20-21
3 材料和方法  21-28
  3.1 材料  21-22
  3.2 方法  22-28
    3.2.1 临床分离菌的分离和鉴定  22
    3.2.2 液、固培养基及平板的制备、细菌菌液的制备及试剂的制备  22-24
    3.2.3 ESBLs的检测  24-25
    3.2.4 细菌对药物敏感性测定  25
    3.2.5 ESBLs的基因型检测  25-27
    3.2.6 产物的纯化、克隆  27-28
4 结果与分析  28-40
  4.1 鸡源大肠杆菌ESBLs的检测结果  28-30
  4.2 细菌敏感性测定结果  30-36
  4.3 产ESBLs鸡大肠杆菌的PCR扩增结果  36-39
  4.4 测序结果及同源性比较结果  39-40
5 讨论  40-44
  5.1 ESBLs的表型鉴定方法  40-41
  5.2 细菌敏感性测定  41-43
  5.3 鸡大肠杆菌基因型  43-44
6 结论  44-46
参考文献  46-52
英文摘要  52-54

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医基础科学 > 家畜微生物学（兽医病原微生物学） > 病原细菌
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