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光合细菌羰基还原酶不对称加氢催化体系的研究

作　者: 岳竹
导　师: 王梦亮
学　校: 山西大学
专　业: 微生物学
关键词: 类球红杆菌 羰基还原酶 不对称还原 苯乙酮
分类号: Q814.9
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 62次
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内容摘要


随着人们对不对称合成手性化合物的深入研究,生物不对称加氢发展为现代研究的热点和焦点。生物催化一般选择微生物整体细胞为催化剂,因其具有反应条件温和、效率高、产物比较单一等优点,后来研究发现其反应体系中存在酶位点选择性低、底物浓度的限制等问题。目前,研究人员利用分离纯化的羰基还原酶还原潜手性化合物,不仅可以增加酶与底物的接触机会,提高光学纯度,而且可以进一步了解酶的作用机制,因此酶法还原再次掀起了国内外研究手性化合物的新浪潮。本课题一方面从光合细菌中分离纯化出羰基还原酶,并对其酶学性质进行研究；另一方面是建立羰基还原酶催化体系,并优化其催化条件,选择催化的最适底物,为研究酶催化机制和实现工业化生产奠定基础。其主要内容如下：1.通过超声破碎、硫酸铵沉淀、DEAE-Sephadex A-25阴离子交换层析三步纯化分离得到一种较纯的依赖于辅酶NADPH的羰基还原酶。该酶的比活从0.9 U/mg提高到36 U/mg,纯化倍数为40。对其进行SDS-PAGE电泳分析,显示一条带,并测得其相对分子量约为37 kD。2.采用紫外测定酶活,对该酶的酶学性质进行研究。结果表明：酶的最适pH值为8,最适温度为37℃,在pH值为7-9之间比较稳定,但其热稳定性较低。该酶对苯乙酮的米氏常数Km值和最大反应速率Vmax分别为0.26 mmol/L和2.4μmol/(min mg)。3.构建了辅酶再生体系、羰基还原酶催化苯乙酮体系以及酶催化与辅酶再生偶联体系,并对催化体系进行优化。结果表明,该酶催化苯乙酮的最佳条件：底物浓度为2.5 mmol/L,反应温度为37℃,反应时间为24 h,此时苯乙酮的产率可达到49.3%、ee值为99%。4.采用气相色谱为检测手段,考察了酶对芳香酮类、脂肪酮类化合物的还原。结果显示该酶对电负性强的基团在苯乙酮α位取代的衍生物以及五碳脂肪酮的专一性较强；且具有极高的立体选择性,都在99%以上。

全文目录


中文摘要  10-11
ABSTRACT  11-13
第一章 绪论  13-24
  1.1 生物不对称合成  13-19
    1.1.1 手性化合物的意义及合成方法  13-15
    1.1.2 生物催化羰基不对称加氢反应  15-16
    1.1.3 生物催化剂  16-18
    1.1.4 整体细胞催化和酶催化  18-19
  1.2 羰基还原酶催化的研究进展  19-23
    1.2.1 羰基还原酶分离纯化的研究  19-20
    1.2.2 羰基还原酶的酶学特性的研究  20-21
    1.2.3 影响羰基还原酶不对称还原的因素  21
    1.2.4 羰基还原酶的底物特异性  21-23
  1.3 本课题的研究目的与主要内容  23-24
第二章 光合细菌羰基还原酶的分离纯化  24-31
  2.1 材料与方法  24-26
    2.1.1 实验材料  24
    2.1.2 主要仪器  24-25
    2.1.3 实验方法  25-26
  2.2 结果与分析  26-30
    2.2.1 酶的分离纯化  26-28
    2.2.2 纯化结果  28-29
    2.2.3 酶纯度检测结果  29-30
  2.3 小结  30-31
第三章 光合细菌羰基还原酶酶学性质的研究  31-36
  3.1 材料与方法  31-32
    3.1.1 实验材料  31
    3.1.2 实验试剂  31
    3.1.3 实验仪器  31
    3.1.4 实验方法  31-32
  3.2 实验结果  32-35
    3.2.1 辅酶依赖性  32-33
    3.2.2 最适pH值  33
    3.2.3 最适温度  33-34
    3.2.4 酶的pH值稳定性  34
    3.2.5 酶的热稳定性  34-35
    3.2.6 K_m值的测定  35
  3.3 小结  35-36
第四章 羰基还原酶催化苯乙酮体系构建及催化条件的优化  36-45
  4.1 材料与方法  36-37
    4.1.1 实验材料  36
    4.1.2 实验试剂  36
    4.1.3 实验仪器  36-37
    4.1.4 实验方法  37
  4.2 实验结果  37-44
    4.2.1 氢化酶再生辅酶NADPH  37-38
    4.2.2 菌绿素再生辅酶NADPH  38-40
    4.2.3 产物分析  40-41
    4.2.4 酶催化苯乙酮的结果  41-42
    4.2.5 底物浓度对催化合成的影响  42-43
    4.2.6 反应温度对合成的影响  43
    4.2.7 反应时间对催化合成的影响  43-44
  4.3 小结  44-45
第五章 光合细菌羰基还原酶催化不同类羰基化合物的研究  45-54
  5.1 材料和方法  45-46
    5.1.1 实验材料  45
    5.1.2 实验试剂  45
    5.1.3 实验仪器  45
    5.1.4 实验方法  45-46
  5.2 实验结果  46-52
    5.2.1 芳香酮类化合物的还原  46-51
    5.2.2 简单脂肪酮类化合物的还原  51-52
  5.3 小结  52-54
第六章 结论与展望  54-56
  6.1 主要结论  54-55
  6.2 展望  55-56
参考文献  56-61
攻读学位期间取得的研究成果  61-62
致谢  62-63
个人简况及联系方式  63-65

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中图分类: > 生物科学 > 生物工程学（生物技术） > 酶工程 > 酶的应用
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